一例气单胞菌引起池塘草鱼死亡案例

■ 田海军李世伟2（ 信阳农林学院水产学院 464000；2 厦门利洋水产科技有限公司 350200）

一例气单胞菌引起池塘草鱼死亡案例

■ 田海军1李世伟12（1 信阳农林学院水产学院 464000；2 厦门利洋水产科技有限公司 350200）

图1 发病草鱼

图2 病原菌分离与纯化培养

图3 分离菌革兰氏染色

草鱼，属于鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属，俗称鲩鱼。因其生长迅速、饵料来源广泛，并且生长迅速、产量高，成为中国淡水养殖的四大家鱼之一。草鱼是我国特有鱼类，但以其独特的食性和觅食手段从而被当做拓荒者移植到世界各地。草鱼养殖过程中容易患上烂腮、肠炎、赤皮、病毒性出血病等多种疾病，细菌性病原致病的情况很严重，因此，通过对草鱼细菌性疾病的病原菌分离与鉴定对草鱼病害的防治具有较大意义。

1 材料和方法

1.1 发病草鱼

今年3月，广东珠海一草鱼养殖池塘开始出现草鱼死亡，池塘面积8亩，3台叶轮式增氧机，水深1.8 m，7,500 kg鱼，养殖前没有清塘，从3月中期开始，每天死亡十几条，观察发病草鱼，鱼体表发红，尾鳍发白，鳃盖、鳍条充血，剪开肚子有腹水，肝脏发黑，肠空、发红（如图1）。

1.2 实验材料

LB固体培养基、70%酒精、冰箱、恒温培养箱、压蒸汽灭菌锅、显微镜、培养皿、烧杯、研钵、试管、接种环、酒精灯等。

1.3 病原菌的分离与纯化培养

在无菌条件下，先用70%酒精对鱼体表面消毒，然后分别取草鱼的肝脏、肾脏、脾脏于无菌研钵中捣碎。

分别加少量无菌水后分别划线接种于LB固体培养基平板上，放入28℃恒温培养箱中培养24h。

选取平板上的优势菌落进行纯化培养，最终培养至3～5代后获得形态一致的纯菌落。

选取单个菌落经过涂片、HE染色、镜检，确认为纯培养物。

选取一个优势菌落，在LB固体培养基斜面上-80℃冰箱保存（通过抑制酶的活性来抑制细胞的生命活动的方式延长细胞存活时间），备用。

1.4 分离菌菌落观察

将纯培养物接种于LB固体培养基平板上，在28℃恒温培养箱中培养24h，观察并记录培养出的细菌菌落特征。将获得的纯培养物进行革兰氏染色：在载玻片上加1滴无菌水，用接种环挑取少许菌落与无菌水混合并进行均匀涂布；经自然干燥、火焰固定后，用草酸铵结晶紫染液染色1～2min，加水冲洗；再加革兰氏碘液后1～2min，加水冲洗，再加复红酒精染液等50～60s后加水冲洗；等待干燥后镜检。菌体被染成紫蓝色为阳性，被染成红色则为阴性。

1.5 病原菌的鉴定

采用API细菌数值鉴定系统，这是同时能测定20项以上生化指标，可用做快速鉴定细菌的长形卡片（21cm×4.5cm，法国生产），上面排列着20个塑料管，管内加有适量糖类等生化反应的干粉（有标签表明）以及反应产物的显色剂。每份产品都有薄膜覆盖，这样保证无杂菌污染。

使用时，首先打开内部附有的一瓶无菌基本培养基（液体），用来稀释待鉴定的纯菌落；

把配制成的浓度适中的细菌悬液用无菌滴管逐个以0.1ml的量加入到每个小管中；

在经过24～28h保温后，观看每个小管是否发生了显色反应；

将结果记录在相应表格中，然后按照规定对结果进行编码、查检索表，就可以获得该菌种的鉴定结果。

1.6 药敏试验

药敏试验采用的是纸片法（购自杭州某微生物试剂公司），选用在生产上常用的药物进行试验研究。

首先进行细菌培养，用无菌生理盐水洗后吸取0.2mL菌液在LB固体培养基平板上进行均匀涂布。

贴上药敏纸片，设4个平行实验组。

放置于28℃的恒温培养箱中培养24h。

观察有无抑菌圈产生，同时记录抑菌圈直径，计算其平均值；然后再重复做1次实验；最后依据抑菌圈直径比值照判断标准得到药敏实验结果。

1.7 临床用药

根据药敏试验结果和池塘情况使用药物治疗

2 结果

2.1 病原菌分离与纯化培养结果

在LB固体培养基上形成菌落为其菌落形态：圆形、圆滑、湿润边缘整齐、微凸、半透明、灰白色至淡黄色中等大小的菌落，易挑取（见图2）。

2.2 分离菌镜检结果

革兰染色阴性，短杆菌，悬滴标本观察动力，运动活泼（见图3）。

2.3 分离菌生理生化试验结果(见表1)

表1 细菌生理生化试验结果

2.4 药敏试验结果

分离菌药敏试验结果（见表2）。

表2 药敏试验结果

2.5 临床治疗结果

用药：第1d， 阴雨天，死亡15条左右，上午10点，使用诺氟沙星、盐酸小檗碱混合制剂（1包）拌两包料。

第2d，阴雨天，死亡6条，下午17点，诺氟沙星、盐酸小檗碱混合制剂（1包）拌1包料。

第3d，阴天，死亡6、7条，上午10点喂诺氟沙星、盐酸小檗碱混合制（剂1包）拌2包料。

草鱼死亡量明显减少得到控制。

3 讨论

根据分离菌的形态特征、培养特性和生化特性等试验结果确定该分离病原菌为气单胞菌。气单胞菌，广泛分布于自然界中，能从表层和地下来源的饮用水中分离出该菌，气单胞菌属已经被国际上列为肠道致病菌之一，是危害草鱼的主要病原菌之一，感染后可发生胃肠炎、外伤感染和败血症并具有高死亡率。试验从草鱼的肝脾肾等组织中分离出了气单胞菌，为临床治疗提供了理论依据。但由于时间等多种条件限制，不能做回归实验。

由药敏试验结果可知病原菌对诺氟沙星、盐酸小檗碱、氟甲喹、恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感。临床上选用这些高敏药物进行治疗，根据药物特性采用了拌料口服的方式。诺氟沙星（Norfloxacin）化学名为1-乙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸，作用原理为通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡，是氟喹诺酮类抗菌药，对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高。盐酸小柴碱是小檗碱（Berberine）的盐酸盐（俗称盐酸黄连素），小檗碱分子式[C20H18NO4]+，是一种异喹啉生物碱，又称黄连素，存在于小檗科等4科10属的许多植物中，抗菌谱广，体外对多种革兰阳性及阴性菌均具抑菌作用，临床主要用于肠道感染及菌痢等。

具体治疗：因前期没有清塘，草鱼出现死亡后用了絮凝的净水产品，使塘底滋生了更多的有害细菌。后来又用了很多杀虫的药物，破坏了水体的生态平衡，加上一直阴雨天气，池塘自净能力差，溶氧一直不高，建议首先控制好死亡量，然后改善好池塘环境，最后再根治鱼病。在注意增氧的前提下连续3d每天1包鳃皮肠利康拌料，草鱼食欲恢复，死亡数量明显减少。

气单胞菌致病是由多种致病因子协同作用的结果，指导临床用药时为防止滥用抗生素而引起的病原菌抗药性问题，对分离的病原菌用药敏试验测定后再合理选用药物治疗才能达到最好的效果。该菌以往被认为是低毒力条件性病原菌，但近年来该菌引起感染性疾病的报道日益增多，并对多种抗生素产生不同程度的耐药性，需要加以重视，注意卫生等各方面管理。临床上，早发现，早治疗，防止多种病原交叉感染，提高机体抵抗力，科学养殖。（参考文献略）