pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的实验研究

曲　莉，赵大力，谢忠伟，刘　斌，李小冬，王　丹，刘　扬，齐亚莉

（1.北华大学公共卫生学院，吉林吉林　132011；2.吉林（市）出入境检验检疫局，吉林吉林　132013；3.吉林大学公共卫生学院，吉林长春　130021）

pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的实验研究

曲莉1，赵大力2，谢忠伟2，刘斌1，李小冬1，王丹1，刘扬3，齐亚莉1

（1.北华大学公共卫生学院，吉林吉林132011；2.吉林（市）出入境检验检疫局，吉林吉林132013；3.吉林大学公共卫生学院，吉林长春130021）

目的研究pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞的杀伤效应，为增强肿瘤放疗效果提供实验证据.方法应用Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡；应用酶标仪检测细胞增殖；应用流式细胞仪检测细胞周期.结果不同处理组作用MCF-7细胞后24 h、不同剂量X射线照射后24 h后，各处理组MCF-7细胞的生长抑制率呈上升态势，生长抑制由弱到强的顺序为:2.0Gy，pEgr1-Trail+0.5Gy，5.0Gy，pEgr1-Trail+1.0Gy，pEgr1-Trail+2.0Gy，Egr1-Trail+5.0Gy.各处理组联合2.0Gy X射线照射后6 h，细胞凋亡率开始上升，48 h达高峰，其中pEgr1-Trail+2.0Gy组与其他各处理组比较差异具有统计学意义，且细胞凋亡最为显著（P＜0.05）.在细胞周期方面，2.0Gy X射线照后6 h各处理组S期细胞百分数呈现上升趋势，24 h达高峰；照后24 h，G2+M期细胞百分数开始上升，且各处理组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；照后48 h，G2+M期细胞百分数达到最高，依旧是pEgr1-Trail+2.0Gy组上升最显著.结论pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射作用于肿瘤细胞表现出协同杀伤效应，促凋亡作用强于单独X射照射组或pEgr1-Trail基因干预组.

pEgr1-Trail重组质粒；电离辐射；MCF-7细胞；杀伤效应

【引用格式】曲莉，赵大力，谢忠伟，等.pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的实验研究［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）:344-348.

肿瘤治疗主要以手术、放疗、化疗以及基因治疗为主.目前，多种方法联合使用已成为肿瘤治疗的主要手段［1］.肿瘤的基因-放射治疗既能提高肿瘤的辐射敏感性，又能减少正常组织的放射损伤，因而成为肿瘤治疗的新思路［2］.本研究利用Egr-1启动子能够诱导Trail基因表达增强以及Trail基因对肿瘤的促凋亡作用，将放射治疗和基因治疗结合，探讨 pEgr1-Trail重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤效应的影响.

1　材料与方法

1.1细胞系和主要试剂

pEgr1-Trail重组质粒由吉林大学公共卫生学院放射卫生教研室刘扬博士惠赠，MCF-7细胞为本研究室保存.用含10%FBS的高糖DMEM培养基在37℃，5%CO2培养箱中培养，当MCF-7细胞融合度达到70%左右，使用0.25%的胰酶消化传代培养. Annexin V/PI凋亡检测试剂盒（南京凯基）；碘化丙啶（美国Sigma）；DMEM培养基（美国Gibco）.

1.2照射条件

医用X射线深部治疗机（丹东市康佳医用机厂），其电压为180 kV，电流为20mA，滤板为0.25 mm Cu和1.0mm Al，剂量率为0.41Gy/min.

1.3细胞增殖的检测

使用酶标仪检测各处理组细胞增殖情况.将MCF-7细胞接种于96孔板，每孔大约接种6×104个细胞，设6个复孔，培养12 h后，使用不同浓度pEgr1-Trail重组质粒转染MCF-7细胞，24 h后给予2.0Gy X照射，并于照后6，12，24和48 h每孔加入10μLCCK-8试剂，培养2 h后，使用酶标仪（A490）检测各孔吸光度值.

1.4细胞凋亡的检测

Annexin V-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡.将MCF-7细胞接种于24孔培养板，每孔5.0×105个细胞，设6个复孔，不同浓度pEgr1-Trail重组质粒转染MCF-7细胞，培养24 h，再经2.0 Gy X线照射后，分别于6，12，24和48 h收集细胞，并给予相应的处理:1）1 500 r/min离心3 min；2）0.01 mol/L PBS洗涤2次；3）800μL缓冲液重悬细胞沉淀；4）加入Annexin V-EGFP 6μL+PI 6μL；5）混匀后室温避光保存15min.分别收集1.0×104个细胞，2 h内使用流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡情况，应用CellQuest系统软件进行数据处理，用凋亡细胞百分率描述分析结果.

1.5细胞周期的检测

使用24孔培养板接种MCF-7细胞，细胞密度为每孔5.0×105个，设6个复孔.不同浓度pEgr1-Trail重组质粒转染MCF-7细胞，在培养箱中培养24 h，再经2.0Gy X射线照射，分别于照射后6，12，24和48 h收集细胞，离心、清洗细胞步骤同细胞凋亡的检测.最后，分别加入RNAse A 100μL和PI 200μL，混匀后室温避光保存20min，分别收集1.0 ×104个细胞，2 h内流式细胞仪检测各期细胞百分率，并使用ModFit软件分析数据.

2　结　果

2.1pEgr1-Trail重组质粒对MCF-7细胞生长的影响

以不同浓度的pEgr1-Trail重组质粒转染MCF-7细胞，分别于转染12，24和48 h后使用酶标仪检测其吸光度值.结果表明:同一时点，随着pEgr1-Trail重组质粒浓度的增加，细胞生长被抑制，并呈现出剂量反应关系.即剂量10 mol重组质粒转染MCF-7细胞培养48 h后，检测到MCF-7细胞的生长受到抑制.随着重组质粒浓度的升高与0mol组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着时间的延长，细胞生长亦受到抑制.见表1.

表1　MCF-7细胞转染不同浓度pEgr1-Trail重组质粒后吸光度值变化Tab.1　Absorbance value changes of MCF-7 cells after being infected by different concentrations of pEgr1-Trail recombinant plasm id　（n=6，±s）

表1　MCF-7细胞转染不同浓度pEgr1-Trail重组质粒后吸光度值变化Tab.1　Absorbance value changes of MCF-7 cells after being infected by different concentrations of pEgr1-Trail recombinant plasm id　（n=6，±s）

注:与0mol组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01

剂量/mol　转染pEgr1-Trail重组质粒后MCF-7细胞A490值时程变化/h 12　24　48 0 0.753±0.002　0.779±0.038　0.945±0.076 10　0.699±0.024　0.728±0.036　0.801±0.027**50　0.615±0.021*　0.653±0.019**　0.759±0.036**100　0.478±0.045**　0.487±0.029**　0.464±0.019**

2.2不同照射剂量各组吸光度值变化

以10mol重组质粒转染MCF-7细胞，培养24 h后分别给予不同剂量X射线照射，再培养24 h，采用酶标仪检测 A490值.结果提示:各处理组MCF-7细胞生长受到抑制，并呈现剂量反应关系. pEgr1-Trail组从1.0Gy开始与对照组和空质粒组比较差异均具有统计学意义（P＜0.01或P＜0.05）.见表2.

表2　不同照射剂量MCF-7细胞各处理组吸光度值变化Tab.2　Absorbance value changes of MCF-7 cells after exposing under different dosages of irradiation （n=6，±s）

表2　不同照射剂量MCF-7细胞各处理组吸光度值变化Tab.2　Absorbance value changes of MCF-7 cells after exposing under different dosages of irradiation （n=6，±s）

注:与对照组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01；与pEgr1-Trail组比较，#:P＜0.05，##:P＜0.01

照射剂量/Gy　对照组　空质粒组　pEgr1-Trail组0 0.917±0.036　0.865±0.021　0.863±0.031 1.0　0.848±0.029　0.833±0.017#　0.795±0.022**2.0　0.839±0.012　0.818±0.016*##　0.739±0.015**5.0　0.854±0.024　0.781±0.025**##　0.697±0.037**

2.3重组质粒联合2.0 Gy X射线照射对MCF-7细胞生长抑制的时程效应

以10mol重组质粒转染MCF-7细胞，培养24 h后给予2.0Gy X射线照射，分别应用CCK-8试剂盒，于照后6，12，24和48 h使用酶标仪检测其吸光度值.结果表明:2.0Gy X线照射后，重组质粒转染的各处理组细胞生长均受到抑制，具有时程量效关系.与其他各组比较，pEgr1-Trail+2.0 Gy组细胞生长抑制程度最为明显，且差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）.见表3.

表3　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞吸光度值时程变化Tab.3　Absorbance-time value changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

表3　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞吸光度值时程变化Tab.3　Absorbance-time value changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

注:与对照组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01；与pEgr1-Trail+2.0Gy组比较，#:P＜0.05，##:P＜0.01

组别　不同时间各处理组MCF-7细胞吸光度值/h 6 12　24　48对照组　0.723±0.026　0.784±0.015　0.831±0.027　0.957±0.014空质粒组　0.728±0.017#　0.786±0.015#　0.825±0.016##　0.913±0.024**##pEgr1-Trail组　0.724±0.012#　0.771±0.028#　0.817±0.012##　0.907±0.013**##2.0Gy　0.725±0.024#　0.778±0.025#　0.792±0.021##　0.881±0.028**##空质粒+2.0Gy　0.717±0.016　0.748±0.014　0.789±0.016*##　0.883±0.017**##pEgr1-Trail+2.0Gy　0.665±0.016*　0.711±0.014**　0.719±0.022**　0.657±0.025**

2.4重组质粒联合2.0 Gy X射线照射对MCF-7细胞凋亡的作用

以10mol重组质粒转染MCF-7细胞，经培养箱培养24 h后，给予2.0Gy X射线照射，分别于照射后6，12，24和48 h收集细胞，经Annexin V-EGFP和PI双荧光染色，流式细胞仪分析细胞凋亡情况.结果表明:照射后6 h各处理组细胞开始出现凋亡，48 h达到峰值，其中以pEgr1-Trail+2.0Gy组细胞凋亡最明显，与其他各处理组比较差异具有统计学意义（P＜0. 05或P＜0.01）.见表4.

表4　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞凋亡变化Tab.4　Apoptosis changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

表4　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞凋亡变化Tab.4　Apoptosis changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

注:与对照组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01；与pEgr1-Trail+2.0Gy组比较，##:P＜0.01

组别t/h 6 12　24　48对照组　3.26±0.55　3.33±0.45　3.32±0.61　3.94±0.79空质粒组　3.58±0.37##　3.87±0.64##　5.72±0.76##　7.93±0.68##2.0Gy　5.48±0.75*##　8.55±0.48**##　14.07±1.01**##　19.34±0.78**##空质粒+2.0Gy　7.29±0.37**##　10.59±0.56**##　15.91±1.02**##　22.68±0.97**##pEgr1-Trail　8.12±0.93**##　12.86±1.53**##　15.49±0.33**##　25.71±0.86**##pEgr1-Trail+2.0 Gy　11.97±0.64**　18.97±1.71**　30.59±2.62**　44.75±1.41**

2.5重组质粒联合2.0 Gy X射线照射对MCF-7细胞周期进程的作用

以10mol重组质粒转染MCF-7细胞，在培养箱中培养24 h后，再经2.0Gy X射线照射处理，并于照射后6，12，24和48 h收集细胞，经PI单荧光染色，采用流式细胞仪分析细胞周期的变化.结果表明:照射后6 h各处理组细胞S期百分数开始增加，12 h后达到峰值水平（P＜0.01），24 h后G2+M期细胞百分数开始增加，除空质粒组外，其余各组与对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.01），48 h后G2+M期细胞百分数达到最高，以pEgr1-Trail+2.0Gy组增加最明显，且差异具有统计学意义（P＜0.01）.见表5.

表5　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞周期变化Tab.5　Cell cycle changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

表5　2.0Gy X线照射后各不同处理组MCF-7细胞周期变化Tab.5　Cell cycle changes of MCF-7 cells after 2.0Gy X-ray irradiation in different treatment groups （n=6，±s）

注:与对照组比较，*:P＜0.05，**:P＜0.01；与pEgr1-Trail+2.0 Gy组比较，##:P＜0.01

组别　6 h 12 h G0/G1　S　G2+M　G0/G1　S　G2+M对照组　56.88±0.22　29.47±0.69　13.75±0.89　58.78±1.15　38.20±1.83　2.47±0.79空质粒组　58.13±0.29*##　31.54±0.35**##　10.33±0.62**##　55.37±0.58**##　39.84±1.19**##　4.79±1.09**##pEgr1-Trail组　57.40±1.17**##　32.51±0.17**##　10.09±1.00**##　53.28±1.62**##　43.71±1.20**##　3.01±0.51 2.0Gy　50.95±1.48**##　33.72±0.41**##　14.53±1.00　41.64±2.32**##　56.57±2.56**##　1.80±0.24空质粒+2.0Gy　50.03±0.83**　36.40±0.33**##　13.58±0.54**##　39.40±0.53**##　55.95±1.22**　4.66±1.43**##pEgr1-Trail+2.0Gy　50.45±0.82**　37.24±0.98**　12.31±0.96　34.73±1.56**　62.67±3.48**　2.60±2.29组别　24 h　48 h G0/G1　S　G2+M　G0/G1　S　G2+M对照组　58.61±1.97　43.86±2.58　2.98±0.79　57.48±1.550　36.32±1.79　10.18±0.98空质粒组　50.16±1.17**##　47.39±1.92**##　2.45±2.43##　51.62±3.50**##　34.19±2.81**　14.19±6.31**##pEgr1-Trail组　48.04±1.03##　44.33±1.14*##　7.64±2.24**##　45.54±3.49**##　38.05±5.08**##　16.41±4.86##2.0Gy　26.67±0.95**　58.58±0.69**##　14.75±0.78**#　36.79±2.01**##　16.07±1.51**##　47.14±1.00**##空质粒+2.0Gy　24.81±1.94**　60.56±3.83**##　14.62±1.24**##　34.65±6.41**##　18.05±0.88**##　49.28±2.23**##pEgr1-Trail+2.0Gy　16.29±1.63**　66.70±2.72**　17.02±1.02**　29.92±3.40**　8.64±2.07**　61.43±1.80**

3　讨　论

3.1重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞杀伤的协同作用

10mol重组质粒转染MCF-7细胞后，在培养箱培养24 h后，分别给予不同剂量X射线照射，各处理组MCF-7细胞随着照射剂量的增加，其生长抑制率呈现上升趋势，以pEgr1-Trail组最明显.另外，pEgr1-Trail联合2.0Gy X射线照射对MCF-7细胞生长抑制的时程效应，也说明重组质粒联合电离辐射具有杀伤肿瘤细胞的协同作用.本实验结果与相关文献报道一致［3］.

3.2重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞凋亡的影响

本实验用pEgr1-Trail联合2.0Gy X射线照射，观察MCF-7细胞凋亡情况.实验结果提示:MCF-7细胞经照射后6 h，各处理组细胞凋亡率开始增加，48 h达高峰，pEgr1-Trail+2.0Gy组与其他各处理组比较差异最显著.实验结果提示:电离辐射联合重组质粒组的促凋亡作用强于单独X线照射组，此结果与相关报道［4-6］一致；Egr-1可调控Trail基因，促进肿瘤细胞凋亡，同时与电离辐射联合作用可发挥协同杀伤效应.

3.3重组质粒联合电离辐射对MCF-7细胞周期各时相的影响

流式细胞仪分析了不同处理组MCF-7细胞周期各时相的情况.经2.0Gy X射线照射6 h后，各处理组细胞S期百分数开始增高，12 h达到峰值；24 h后G2+M期细胞百分数开始上升，48 h达高峰，其中以pEgr1-Trail+2.0 Gy组变化最明显.以上结果表明:各处理组MCF-7细胞周期以S和G2+M期阻滞为主，G0/G1期阻滞不显著；与前面的实验结果相似，依然是重组质粒联合2.0Gy X射线照射组导致S和G2+M期阻滞最显著，这可能与MCF-7细胞内p53的状态有关，突变的p53不能引起细胞G0/G1期阻滞［7-8］.

Trail作为肿瘤坏死因子超家族成员之一，是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，在调节细胞死亡、免疫反应和炎症等方面发挥着重要作用.上述实验结果证实了Trail基因的肿瘤杀伤效应，以及联合放疗而产生的协同杀伤作用.利用Egr-1作为启动子，并调控Trail基因表达，构建辐射诱导表达载体，可提高肿瘤基因-放射治疗的效果，已成为肿瘤治疗的新方法和新思路.

［1］A l-Khami A A，Mehrotra S，Nishimura M I.Adoptive immunotherapyof cancer:Genetransfer of Tcell specificity［J］.Self Nonself，2011，2（2）:80-84.

［2］Desilet N，Campbell T N，Choy F Y.p53-based anticancer therapies:An empty promise？［J］.Curr Issues Mol Biol，2010，12（3）:143-146.

［3］Lim L Y，Vidnovic N，Ellisen L W.Mutant p53 mediates survival of breast cancer cells［J］.Curr Issues Mol Biol，2009，12（3）:143-146.

［4］He X，Liu J，Yang C，et al.5/35 fiber-modified conditionally replicative adenovirus armed with p53 shows increased tumor-suppressing capacity to breast cancer cells［J］.Hum Gene Ther，2011，22（3）:283-292.

［5］Zhang Y，Shi Y，Li X，et al.Inhibition of the p53-MDM2 interaction by adenovirus delivery of ribosomal protein L23 stabilizes p53 and induces cell cycle arrest and apoptosis in gastric cancer［J］.J Gene Med，2010，12 （2）:147-156.

［6］Li Y，Li L J，Zhang ST，et al.In vitro and clinical studies of gene therapy with recombinant human adenovirus-p53 injection for oral leukoplakia［J］.Clin Cancer Res，2009，15（21）:6724-6731.

［7］Idogawa M，Sasaki Y，SuzukiI H，et al.A single recombinant adenovirus expressing p53 and p21-targeting artificial microRNAs efficientlyinduces apoptosis in human cancer cells［J］.Clin Cancer Res，2009，15（11）: 3725-3732.

［8］Song X，Varker H，Elchelbaum M，et al.Treatment of lung cancer patients and concomitant use of drugs interacting with cytochrome P450 isoenzymes［J］.Lung Cancer，2011，74（1）:103-111.

【责任编辑：陈丽华】

Experimental Research on Killing Effects of pEgr1-Trail Recombinant Plasmid Combined with Ionizing Radiation on MCF-7 Cell

Qu Li1，Zhao Dali2，Xie Zhongwei2，Liu Bin1，Li Xiaodong1，Wang Dan1，Liu Yang3，Qi Yali1
（ 1.Public Health College of Beihua University，Jilin 132011，China； 2.Jilin Province （ City） Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jilin 132013，China； 3.School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China）

Objective To study the killing effects of pEgr1-Trail recombinant plasmid combined with ionizing radiation on MCF-7 cell，and to provide experimental evidence for improving curative effects of radiotherapy for tumor. Method Annexin V-EGFP /PI was used to detect cell apoptosis，cell proliferation was detected by ELIASA，and cell cycle was determined by flow cytometer.Results After being irradiated for 24 h by differentdoses of X-ray，the growth inhibition rates of MCF-7 cell in different treatment groups all increased with the order of 2.0 Gy，pEgr1 Trail+0.5 Gy，5.0 Gy，pEgr1-Trail+1.0 Gy，pEgr1-Trail+2.0 Gy，pEgr1-Trail+5.0 Gy.Compared with other groups，PEgr1-Trail group had significant difference （ P＜0.05） . In the combination of 2.0 Gy X-ray irradiation for 6 h，apoptosis rates of each group started to rise，and reached peak at 48 h.Compared with other treatment group，cell apoptosis of pEgr1-Trail +2.0 Gy group was the most obvious （ P＜0.05） .As for cell cycle， compared with the control group，cell percentage in S phase of each treatment group began to rise after being irradiated by 2.0 Gy X-ray for 6 h，and got to peak at 12 h （ P＜0.05） .After 24 h，cell percentages in G2+M phase began to rise，and the differences among different treatment groups were all significant （ P＜0.05） .After 48 h，cell percentages in G2+M phase were the highest，and the percentage was aslo the most obvious in pEgr1-Trail+2.0 Gy group.Conclusion PEgr1-Trail recombinant plasmid combined with ionizing radiation exhibit synergistic effect on killing tumour cells，their synergistic effect on promoting apoptosis is better than the single use of X-ray irradiation or gene interference.

recombinant plasmid；ionizing radiation；MCF-7 cells；killing effects

R730

A

1009-4822（2016）03-0344-05

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.013

2015-10-12

吉林省教育厅科学技术研究项目（2014192）.

曲莉（1976-），女，硕士，讲师，主要从事肿瘤毒理学研究，E-mail:418997433@qq.com；通信作者:齐亚莉（1973-），女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事肿瘤的放射基因治疗和流行病学研究，E-mail:374494617@qq.com.