血必净注射液对缺氧/复氧大鼠心肌功能与结构的影响*

何金波,杨　絮，罗梓垠，袁培根，宋　冬，项冰倩，陈锡文，王万铁△

(1.温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所，浙江 温州 325035;2.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)麻醉科,湖北 十堰 442000;3.温州市人民医院，浙江 温州 325000;4.温州医科大学实验动物中心，浙江 温州 325035)



血必净注射液对缺氧/复氧大鼠心肌功能与结构的影响*

何金波1,2+,杨絮3+，罗梓垠1，袁培根1，宋冬1，项冰倩1，陈锡文4△，王万铁1△

(1.温州医科大学缺血-再灌注损伤研究所，浙江 温州 325035;2.十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)麻醉科,湖北 十堰 442000;3.温州市人民医院，浙江 温州 325000;4.温州医科大学实验动物中心，浙江 温州 325035)

目的：探讨不同剂量的血必净注射液对缺氧/复氧大鼠心肌功能的保护作用。方法：采用Langendorff方法制备大鼠离体心脏缺氧/复氧模型。130只雄性SD大鼠随机分为对照组(sham组)，缺氧/复氧组(H/R组)，低、中、高剂量血必净组(XBJL、XBJM、XBJH组),除对照组外，其他四组按复氧不同时相(复氧0.5 h、1 h、2 h)又分别分为3个亚组(n=10)。对照组在平衡灌注20 min时纪录左室发展压(LVDP)、左心室发展压最大上升/下降速率(± dp/dtmax)、左心室内压(LVP)、心率(HR)的值，ELISA检测心肌中肌酸激酶同工酶(CK-MB)的浓度，光镜下观察心肌组织结构的改变；其余各组平衡灌注20 min后，灌注ThomasⅡ停搏液使心脏完全停搏30 min之后复灌K-H液使其心脏复跳，连续记录LVDP、±dp/dtmax、LVP、HR在复氧不同时间点的动态变化，ELISA检测各组复氧不同时间点心肌中CK-MB的浓度，光镜下观察各组复氧不同时间点心肌组织结构的改变。结果：与sham组相比，其余各组LVDP、± dp/dtmax、LVP值均降低(P<0.05)，心肌中CK-MB浓度上升(P<0.05)，心肌组织结构发生异常改变，随着复氧时间延长，以上指标异常变化逐渐加剧；在复氧0.5 h、1 h、2 h，各剂量血必净组 LVDP、±dp/dtmax、LVP的值均高于H/R组对应时间点的值(P<0.05)，心肌中CK-MB浓度均低于H/R组，心肌组织结构异常变化减轻，以中剂量改善效果最佳(P<0.05)。结论：血必净注射液能够有效改善缺氧/复氧大鼠心肌的功能及形态学结构，以中剂量血必净(4 ml/100 ml)效果最佳。

心肌；缺氧/复氧；血必净；心肌功能；心肌结构；大鼠

机体组织器官正常功能的维持取决于良好的血液循环，各种原因所引起的组织和器官的缺氧都会使机体发生缺氧性损伤，及时恢复氧供是治疗的关键，但临床中发现，缺氧组织或器官在恢复氧供后，反而产生了损伤加重的现象，即缺氧/复氧损伤。随着近些年来心肌梗死后冠状动脉再灌注治疗技术的发展，心肌缺氧/复氧损伤(myocardial hypoxia /reoxygenation injury，MH/RI)成为当今医学领域关注的热点。MH/RI在临床上主要表现为再灌注性心律失常、心肌顿抑、心肌酶谱的升高、梗死面积扩大等现象。研究表明，再灌注期间，自由基的大量生成、细胞钙超载、炎症反应、凋亡是导致MH/RI的重要原因[1-3]。

血必净注射液是由红花、川芎、丹参、当归等具有活血化瘀作用药物组成的复方中药制剂，具有改善微循环、保护内皮细胞的作用，可通过抑制白介素、肿瘤坏死因子、细胞间黏附分子等炎性因子的表达发挥抗炎作用，从而对机体的重要脏器起到保护作用。已有研究报道，血必净注射液在MH/RI中起到一定的保护作用[4]。本实验通过Langendorff心脏灌流系统建立大鼠心脏缺氧-复氧模型，模拟临床的体外循环过程，通过对心功能、心肌酶谱、心肌形态学改变的观察，来研究大鼠离体心脏缺氧-复氧后心肌功能、结构的损伤，探究血必净注射液对缺氧-复氧大鼠心肌功能及结构的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠130只，体重(280±30)g，由温州医科大学实验动物中心提供【SYXK(浙)2010-0150】。

1.2主要仪器与试剂

Langendorff离体心脏灌流装置和PowerLab生物信号处理与分析系统由澳大利亚埃德仪器有限公司提供；血必净注射液(国药准字Z20040033)由天津红日药业股份有限公司提供；大鼠CK-MB ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供；其它试剂为市售分析纯产品。改良克氏液(Krebs-Henseleit，K-H，mmol/L)：氯化钠 118.5，氯化钾4.8，硫酸镁1.2，磷酸二氢钾1.2，碳酸氢钠25.0，氯化钙2.5，葡萄糖11.1，pH 7.40±0.05。改良ThomasⅡ停搏液(mmol/L)：氯化钠110，氯化钾16，氯化钙1.2，碳酸氢钠1.0，氯化镁16，pH 7.8±0.05。

1.3大鼠离体心脏缺氧-复氧模型的制备

采用Langendorff方法，大鼠称重后，用5%水合氯醛(7～8 ml/kg)腹腔注射麻醉，开腹，经下腔静脉注射肝素(1000 U/kg)抗凝，迅速开胸取出心脏悬挂在langendorff离体心脏灌流装置上，用95%O2+5%CO2饱和的K-H液经主动脉进行逆行灌注。灌注液温度为37℃±0.5℃，pH 7.40±0.05，灌注压100 mmHg。

1.4实验分组

雄性健康SD大鼠130只，体重(280±30)g，随机分为对照组(sham组)、缺氧/复氧组(H/R组)，低、中、高剂量血必净组(XBJL、XBJM、XBJH组)，H/R组、XBJL组、XBJM组和XBJH组按复氧不同时相(复氧0.5 h、1 h、2 h)又分别分为3个亚组(n=10)。sham组平衡灌注20 min后将心脏保存；H/R 各组在用95% O2+5% CO2饱和的K-H液平衡灌注20 min后，灌注改良ThomasⅡ停搏液使心脏完全停搏30 min之后复灌95% O2+5% CO2饱和K-H液使其心脏复跳并持续灌注，复灌的时间分别为30 min、1 h、2 h；XBJL组、XBJM组和XBJH组分别在改良ThomasⅡ停搏液中加入血必净注射液2 ml/100 ml、4 ml/100 ml、8 ml/100 ml，其他处理与H/R组相同。

1.5监测心功能的指标

从左心耳向左心室插入球囊，球囊内注射适量生理压水，维持左心室舒张末期压力(LVEDP)(4～10)mmHg，通过Powerlab八通道生理记录仪连续记录各组左室发展压(left ventricular development pressure，LVDP)、左心室发展压最大上升速率(maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，± dp/dtmax)、左室内压(left ventricular pressure,LVP)的变化。

1.6ELISA方法检测心肌组织中CK-MB的浓度

各组分别取心肌组织100 mg，在超声匀浆机中充分匀浆，将匀浆液转入1.5 ml EP管中，4℃,3 000 r/min，离心15 min，取上清，用BCA试剂盒对上清液进行蛋白定量，用大鼠CK-MB ELISA试剂盒检测各组大鼠心肌中CK-MB的浓度。

1.7HE染色观察心肌结构

各组灌注完毕后，立即取下心脏，放入冷生理盐水中漂洗，从心尖部同一部位取材，用4%的多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察心肌组织结构的改变。

1.8统计学分析

2　结果

2.1各组大鼠心功能参数的比较

平衡灌注20 min末各组间LVDP、±dp/dtmax、LVP比较差异无统计学意义；与sham组相比，复氧期间H/R组、XBJL组、XBJM组、XBJH组的LVDP、±dp/dtmax、LVP值明显降低(P<0.05)，且随着复氧时间的延长，各组以上指标呈持续下降趋势；XBJL组、XBJM组、XBJH组复氧0.5 h、1 h、2 h的LVDP、±dp/dtmax、LVP值均高于对应时间点H/R组，差异有统计学意义，以XBJM组最为显著(P<0.05，表1)。

2.2各组大鼠心肌组织CK-MB的表达

H/R组、XBJL组、XBJM组和XBJH组复氧0.5 h、1 h、2 h心肌CK-MB的浓度均明显高于sham组(P<0.05)；随着复氧时间的延长，各组心肌中CK-MB的表达持续上升，心肌损伤逐渐加重；XBJL组、XBJM组、XBJH组在复氧0.5 h、1 h、2 h时CK-MB的表达与对应时间点H/R组相比，均有不同程度降低，差异有统计学意义，以XBJM组最为显著(P<0.05,表2)。

Tab.1　Comparison of parameters of cardiac function among groups ±s,n=10)

H/R:Hypoxia /reoxygenation group;XBJL:Low dose XBJ;XBJM:Middle dose XBJ;XBJH:High dose XBJ;XBJ:Traditional Chinese Medicine complex

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs I/R group;ΔP<0.05 vs XBJLgroup;▲P<0.05 vs XBJMgroup

GroupCK-MB(ng/ml)Sham13.7±3.4H/R0.5hafterH/R75.7±8.6*1hafterH/R137.3±9.0*2hafterH/R158.4±8.0*XBJL0.5hafterH/R69.1±14.5*1hafterH/R112.9±6.9*#2hafterH/R138.7±2.4*#XBJM0.5hafterH/R56.4±6.8*#1hafterH/R97.1±10.4*#Δ2hafterH/R119.0±1.0*#ΔXBJH0.5hafterH/R67.3±11.3*1hafterH/R107.2±11.1*#2hafterH/R131.6±2.8*#▲

H/R:Hypoxia/reoxygenation group;XBJL:Low dose XBJ;XBJM:Middle dose XBJ;XBJH:High dose XBJ;CK-MB:Creatine kinase-MB

*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs I/R group;ΔP<0.05 vs XBJLgroup;▲P<0.05 vs XBJMgroup

2.3各组大鼠心肌组织形态学结构的变化

sham组心肌细胞排列整齐，形态正常，细胞核居中，未见炎性细胞浸润(图1A，图1见彩图页Ⅳ)；与sham组相比，H/R组心肌结构损伤较重，复氧0.5 h时，心肌细胞部分出现炎性细胞浸润，复氧1 h时心肌纤维肿胀，变性，部分出现坏死，复氧2 h组心肌纤维出现大范围断裂、溶解(图1B)；血必净处理后，与复氧同时间点H/R组相比，心肌细胞接近正常，排列紧密，血管扩张现象显著缓解，炎症细胞浸润减轻，心肌组织损伤得到了明显改善，以XBJM组最为明显(图1C、D、E)。

3　讨论

随着冠心病，心肌梗死发病率的节节攀高，溶栓治疗、PCI和搭桥手术在心脏外科中的运用也日益广泛，这意味着术后心肌缺血/再灌注损伤会成为困绕临床医师的重要问题。由于作用靶点广泛，中药在预防和治疗围术期心肌缺血/再灌注损伤方面有着独特的优势，也获得了越来越广泛的应用。 血必净方源于血府逐瘀汤，具有活血化瘀、疏通经络、溃散毒邪的功能，能够有效地改善微循环，减轻缺血缺氧所引起的心肌损害，恢复和营养受损的心肌细胞，有早期的组织器官保护功能[5]。有实验证实，血必净注射液能够有效的对抗内毒素诱导的内源性炎性介质释放，减少炎性渗出，调节机体的免疫反应，在应激状态下具有对脏器功能的保护作用[6]。其组分丹参已被证实能够抑制心肌缺血/再灌注过程中心肌细胞凋亡相关基因的表达，保护再灌注心肌[7]。 红花提取物具有抗心肌缺血、抑制血小板聚集、抗氧化等作用[8]，丹参和红花提取物配伍在治疗心肌缺血性疾病方面也收获了良好的效果[9]。川穹嗪、当归配伍使用能有效减少炎症渗出和血小板聚集，增加冠状动脉血流量[10]。

LVDP、±dp/dtmax、LVP是反映心功能的常用指标。LVDP 反映等容收缩期左室内压变化，体现心肌顺应性。+dp/dtmax主要反映室壁张力变化速率，是评价心肌收缩性能的重要指标。-dp/dtmax能够良好的体现心肌舒张功能。LVP与左室功能和心输出量有关。实验结果显示，与sham组相比，复氧期间各组心功能的指标均发生了明显的变化，LVDP、±dp/dtmax、LVP随着复氧时间延长都出现了显著下降；与H/R相比较，XBJ能明显的对抗缺氧/复氧带来的心功能损害，减缓心功能相关指标的下降，以XBJM组效果最明显。作为心肌损伤敏感而特异性的指标，复氧期间心肌CK-MB表达的变化能够有效地反映各组缺氧-复氧损伤的程度，与心功能指标观察结果相一致，XBJ组CK-MB的表达较H/R组明显减轻，也证实了血必净注射液对缺氧/复氧大鼠心肌的保护作用，光镜下对各组大鼠心肌损伤程度的直观反映对这一结果提供了有力的依据。

综上所述，血必净注射液能够有效地对抗大鼠心肌缺氧-复氧过程中心肌功能的下降，降低复氧期间心肌CK-MB的表达，减轻复氧期间心肌结构的损伤，对缺氧-复氧心肌有较好的保护作用，提示血必净注射液对临床上体外循环下心肌缺氧/复氧损伤的治疗有较大的推广意义。

[1]Garciarena CD,Fantinelli JC,Caldiz CI,et al.Myocardial reperfusion injury:reactive oxygen species vs.NHE-1 reactivation[J].Cell Physiol Biochem,2011，27(1):13-22.

[2]Ma HJ,Li Q,Ma HJ,et al.Chronic intermittent hypobaric hypoxia ameliorates ischemia/reperfusion-induced calcium overload in heart via Na/Ca2+exchanger in developing rats [J].Cell Physiol Biochem,2014,34(2):313-324.

[3]Xu T,Wu X,Chen Q,et al.The anti-apoptotic and cardioprotective effects of salvianolic acid a on rat cardiomyocytes following ischemia/reperfusion by DUSP-mediated regulation of the ERK1/2/JNK pathway [J].PloS one,2014,9(7):e102292.

[4]王淑君,王万铁,熊建华,等.红花注射液对实验性脑缺血再灌注损伤中一氧化氮和内皮素的影响[J].中国急救医学,2003,23(5):298-299.

[5]Chang PN,Mao JC,Huang SH,et al.Analysis of cardioprotective effects using purified Salvia miltiorrhiza extract on isolated rat hearts[J].J Pharmacol Sci,2006,101(3):245-249.

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[9]李艳丽,孟智宏.丹红注射液治疗急性冠脉综合征48例[J].实用中医内科杂志,2008,22(3):20-21.

[10]周苏宁.川芎嗪心血管药理研究进展[J].中药药理与临床,2001,17(3):48.

Effects of xuebijing injection on cardiac function and structure in rats with myocardial hypoxia/reoxygenation injury

HE Jin-bo1,2+,YANG Xu3+,LUO Zi-yin1,YUAN Pei-gen1,SONG Dong1,XIANG Bing-qian1,CHEN Xi-wen4△,WANG Wan-tie1△

(1.Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute,Whenzhou Medical University,Whenzhou 325035；2.Department of Anesthesia,TaiHe Hospital of Hubei Medical College,Shiyan 442000;3.The First Clinical College,Whenzhou 325035；4.Experiment Animal Center,Whenzhou 325035,China)

Objective:To investigate the protective effects of xuebijing(XBJ,Traditional Chinese Medicine Complex)injection on cardiac function in rats with myocardial hypoxia /reoxygenation(H/R)injury.Methods:The isolated langendorff perfused rat heart model was established．One hundred and thirty SD rats were randomly divided into sham group,hypoxia /reoxygenation group,low dose XBJ(XBJL)group,middle dose XBJ(XBJM)group and high dose XBJ(XBJH)group.All groups except sham group were divided into three subgroups according to reoxygenation time(0.5 h,1 h,2 h )(n=10).In sham group,left ventricular development pressure(LVDP),maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure(±dp/dtmax),left ventricular pressure(LVP),and heart rates(HR)were recorded after 20 minutes balance perfusion.The creatine kinase-MB(CK-MB)in myocardium was detected by ELISA.In other groups,after 20 minutes balance perfusion,we perfused ThomasⅡto stop the hearts from beating for 30 minutes,then reperfused the K-H until hearts recover beating.The microstructure of myocardium was observed under light microscopy.LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR were continuously recorded in other four groups and the concentrations of CK-MB in myocardium were measured by ELISA at different time points after reoxygenation.Microstructure of myocardium in each group were observed under light microscopy.Results:LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR of other groups were significantly lower than those of sham group(P<0.05).The levels of CK-MB were higher than that of sham group(P<0.05).LVDP,±dp/dtmax,LVP and HR of XBJL,XBJM and XBJH groups were higher than those of I/R group at corresponding time points after reoxygenation(P<0.05).The levels of CK-MB were lower than that of I/R group(P<0.05)and the cardiac function was improved.The middle dose of XBJ had the best protective effect.Conclusion:Xuebijing injection can effectively improve cardiac function and structure in rats with myocardial hypoxia /reoxygenation injury,and middle dose of XBJ is the best.

myocardium;hypoxia/reoxygenation;xuebijing(Traditional Chinese Medicine complex)injection;cardiac function;cardiac structure；rats

浙江省中医药重点研究计划项目(2013ZZ011)；全军医药卫生科研项目(08MA059)

2015-01-20

2015-10-16

△Tel：0577-86689817；E-mail：wwt@wmu.edu.cn.

+:为共同第一作者

R364

A

1000-6834(2016)02-173-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.02.021