大鼠脑出血模型中血脑屏障开放规律及应用脑血疏口服液治疗脑水肿的实验研究

张亚红，刘重霄，周　任，师　蔚，郭振宇



大鼠脑出血模型中血脑屏障开放规律及应用脑血疏口服液治疗脑水肿的实验研究

张亚红，刘重霄，周任，师蔚，郭振宇

目的在建立大鼠脑出血(ICH)模型基础上，通过观察血脑屏障(BBB)开放规律及早期应用药物进行干预，探讨ICH后脑损伤的致病机制及治疗方案。方法选用SD大鼠78只，随机分为ICH组、治疗组和对照组，各组又随机分为1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亚组，ICH组、治疗组注射Ⅳ型胶原酶建立ICH模型，造模后进行脑含水量及伊文氏兰含量测定。结果ICH组：脑出血后早期(1 h)即有脑水肿出现，6 h至3 d脑水肿增加明显，7 d后渐下降；治疗组：脑水肿于3 d左右开始明显增加，7 d后下降。脑出血后BBB变化：1 h脑出血组和治疗组即有伊文氏兰渗出，ICH组分别造模后6 h和3 d达到高峰；治疗组于造模后6 h到达高峰。结论脑血疏口服液可以通过抑制BBB的开放，减轻脑水肿的发生、发展，从而减轻ICH后脑损伤。

脑出血；脑水肿；脑血疏口服液；血脑屏障；中风

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后脑内血肿及其分解产物可引起脑组织继发损伤，并产生一系列病理生理改变。研究表明：脑出血早期即有血脑屏障(blood brain barrier，BBB)破坏并伴有血管源性脑水肿等继发性脑损伤发生，而且随着BBB的破坏及通透性增加，血液成分及其降解产物和炎性细胞大量渗入脑组织中，导致神经元凋亡和脑组织进一步损伤[1]。那么ICH后BBB破坏具体时程如何，目前研究结果仍未有定论，故如何早期对BBB进行干预，是国内外神经科学领域关心的热点。近年的研究表明：脑血疏口服液具有益气、活血、化瘀之功效，临床应用发现其确实对ICH病人颅内血肿吸收起到促进作用[2]，但其确切治疗机制仍未完全明了。本实验拟在建立大鼠ICH模型基础上，观察BBB开放规律及早期应用脑血疏口服液进行干预的效果，ICH后脑损伤的致病机制及治疗方案。

1　材料与方法

1.1动物分组健康清洁SD大鼠78只，体重250 g～300 g，雄性，由西安交通大学动物实验中心提供。实验动物使用随机数字表法分为ICH组、治疗组和对照组。ICH组和治疗组再随机分为1 h、6 h、1 d、3 d、7 d和14 d亚组，每亚组6只大鼠，对照组共6只大鼠，各组间动物体重差异无统计学意义。

1.2ICH动物模型建立用Ⅳ型胶原酶建立ICH模型，大鼠术前12 h禁饮食4 h禁水，0.4%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg)，必要时水合氯醛补充麻醉，保证手术操作期间大鼠有自主呼吸，俯卧位固定于动物头颅立体定向仪上，头皮“钉子型”剪开，取前囟为原点，向右3 mm，向后1 mm，深度5 mm为注射点(尾状核)，磨钻磨开颅骨，进针后缓慢注射Ⅳ型胶原酶、肝素和生理盐水混合溶液(每1 μL含Ⅳ型胶原酶0.2 U及肝素2 U)，留针10 min，缓慢退针，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合头皮。术中注意大鼠呼吸情况并保持呼吸道通畅，大鼠体温控制在36.5 ℃～37.5 ℃，术毕动物送入有空调的动物房饲养。对照组按Ⅳ型胶原酶法注入相同剂量生理盐水；治疗组按上述造模方法每8 h灌服脑血疏口服液1 mL/kg，ICH组及对照组灌服生理盐水。

1.3脑组织含水量测定(干湿重法)术后在相应时间点用过量的水合氯醛麻醉动物，迅速开胸暴露心脏，从左心室插管至主动脉根部，在右心耳剪开一小口当作出口。4%多聚甲醛100 mL快速灌注，之后稍减慢灌注速度继续固定，灌注约30 min至动物四肢变硬，断头取脑，测湿重标本，取ICH侧皮质针孔前组织，厚约3 mm脑组织测定湿重，然后将标本放于95 ℃烘箱中烘干24 h再称重，干湿重均由电子分析天平称量。脑组织含水量按如下公式计算：脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%，干湿重均精确到0.1 mg。

1.4伊文氏兰注射及标本采集对照组注射2%伊文氏兰3 mL/kg后24 h处死，ICH组和治疗组于造模前1 h注射等量的伊文氏兰。取脑前，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。横断面切取损伤平面厚约3 mm的脑组织，将其分为ICH侧皮质、皮质下和健侧皮质、皮质下4个部分，分析天平上称取其湿重，将各部分放入匀浆器匀浆，匀浆液为2 mL的50%三氯乙酸(TCA)，充分匀浆后，将组织匀浆液15 000 r/min离心20 min，在伊文氏兰最大吸收光谱635 nm处检测吸光度，从伊文氏绘制标准曲线上查得伊文氏兰含量结果。

2　结　果

2.1ICH后大鼠脑组织含水量变化规律ICH组在造模后1 h即有脑组织含水量增加，但此时与治疗组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；6 h时ICH组脑含水量较治疗组和对照组增加明显，差异有统计学意义(P<0.05)，但治疗组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；3 d时ICH组含水量达到高峰，与治疗组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，并且此时治疗组和对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；7 d时ICH组脑含水量仍高于对照组和治疗组(P<0.05)，但治疗组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；14 d时ICH组与治疗组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1　ICH后脑组织水肿量变化(±s)　 %

2.2ICH后大鼠脑组织伊文氏兰变化规律ICH后1 h脑出血组和治疗组即有伊文氏兰渗出，ICH组分别造模后6 h和3 d达到高峰；治疗组于造模后6 h达高峰。详见表2。

表2　ICH后大鼠脑组织伊文氏兰变化(±s)　 μg/g

3　讨　论

脑出血是严重危害人类健康的常见病和多发病，ICH后继发性脑损伤是导致ICH病人致残率和死亡率极高的重要原因之一。目前关于ICH后脑损伤的研究认为损伤原因包括两方面：一是原发性脑损伤或称直接脑损伤，其损伤机制为ICH后神经元胞体受到挤压，轴突遭受撕扯、断裂及ICH后神经细胞在营养摄取方面障碍，从而导致相应的脑损伤；二是继发性脑损伤或称间接脑损伤，其损伤机制包括血肿腔及周围急性炎性反应、血细胞的渗出及局部或全身免疫细胞的激活，并释放大量的有害因子(如免疫因子、血红蛋白)造成的脑损伤，同时有血脑屏障的破坏及脑水肿、脑肿胀的形成，最终引起脑疝致病人死亡[3]。有关继发性脑损伤的研究证实：ICH后红细胞成分血红蛋白被释放到脑组织或蛛网膜下腔中，其在代谢过程中产生脂质过氧化反应导致了神经元细胞膜损伤、DNA片断化和细胞凋亡[4-6]。目前研究认为继发性脑损伤在ICH后脑损伤中占有主导地位，而BBB的破坏又是继发性脑损伤的中心环节[7]。

现阶段对BBB开放规律及时间还尚未定论：Hartl等[8]在研究动物脑皮质损伤(cortical contusion injury，CCI)后认为，BBB开放存在两个高峰，BBB于脑损伤后1 h左右首次开放，于24 h达到第1次高峰，其后渐下降。第2次开放高峰形成于伤后第3天；Baskaya等[9]在研究脑外伤(traumatic brain injury，TBI)后提出：脑损伤后BBB两次开放高峰分别形成于4 h～6 h和72 h，并且两次BBB开放与外伤后原发和继发性脑损伤是相对应的，认为脑外伤可以直接导致BBB 破坏即第1次开放高峰的到来，而第2次BBB开放高峰不仅使血细胞外渗，而且还有很多炎性因子也随之渗出，这是炎性因子再次破坏BBB内皮细胞的前提，也为第2次BBB 开放作了准备。本次实验通过观察大鼠ICH后脑组织含水量及检测鼠脑组织中伊文氏兰含量得出了与TBI后BBB开放规律类似的结论：ICH后早期(1 h～6 h)即有BBB开放并有脑水肿发生，至ICH后3 d左右BBB再次开放，同时到达水肿最高峰，7 d后水肿缓慢下降，14 d后基本恢复对照组水平。

脑血疏口服液具有益气、活血、化瘀的作用，其主要成分为黄芪、水蛭、 石菖蒲、牛膝及川芎，主要用于气虚血瘀所致中风病人。近年来，脑血疏口服液广泛应用于出血性脑血管病的治疗，疗效肯定[10]。谢道珍等[2]研究结果显示：将脑血疏口服液用于出血脑中风病人后，其治疗组总有效率高达87.74%。本次实验中，治疗组应用脑血疏口服液进行干预后，BBB开放起始时间较ICH组延后，并且脑水肿程度明显降低。现在对BBB相关研究较多集中在其破坏方式上，主要有两种：其一是毛细血管内皮细胞损伤即细胞的坏死或凋亡；其二是细胞间紧密联结的破坏[11]。那么脑血疏口服液是通过何种渠道对BBB进行保护，这还需进一步研究证实。

综上所述，脑血疏口服液可以减轻ICH后脑损伤的可能机制：通过抑制BBB的开放，减轻脑水肿的发生、发展，从而达到改善神经功能的目的。

[1]Morgenstern LB，Hemphill JC，Anderson C，et al.Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage[J].Stroke，2015，5(9)：2108-2129.

[2]谢道珍，李静，罗林，等.脑血疏通口服液治疗出血性中风的实验研究[J].中国中西医结合杂志，1995，15(s1)：354-357.

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[11]Hoane MR，Kaplan SA，Ellis AL.The effects of nicotimamide on apoptosis and blood-brain barrier breakdown following traumatic brain injury[J].Brain Research，2006，1125：189-193.

(本文编辑郭怀印)

西安交通大学第二附属医院(西安 710004)

郭振宇，E-mail：guozhenyu1818@sina.com

R741R289.5

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．015

1672-1349(2016)14-1613-03

2016-01-09)