乙醇对大鼠不同脏器微动脉的作用及其机制研究

李亚君，刘　宇，牛龙刚，杨逸童，张明升



乙醇对大鼠不同脏器微动脉的作用及其机制研究

李亚君，刘宇，牛龙刚，杨逸童，张明升

目的观察不同预收缩剂基础上乙醇对大鼠不同脏器微动脉的作用及其机制的研究。方法采用PowerLab Chart和DMT微血管环张力记录系统，观察静息状态及不同预收缩剂(0.3 μmol/L U46619、39 mmol/L KCl、0.000 3 μmol/L ET)基础上乙醇对大鼠不同脏器微动脉环的收缩作用并比较其差异性；观察不同激酶抑制剂SB239063、PD98059、Y27632对乙醇所致的冠状动脉环收缩作用的影响；观察钙通道阻断剂硝苯地平对乙醇所致的大脑中动脉环收缩作用的影响。结果静息状态下，0.1%、0.3%、1%浓度的乙醇对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的静息张力无明显作用；在不同的预收缩剂基础上，乙醇对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环有浓度依赖性的收缩作用；在预孵不同激酶抑制剂后，对于不同浓度的乙醇所致冠状动脉环的收缩有不同程度的抑制作用；钙通道阻断剂硝苯地平可以抑制乙醇所致大脑中动脉环的收缩作用。结论在预收缩剂基础上，乙醇对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉具有浓度依赖性的收缩作用，该收缩作用可能与丝裂原活化蛋白激酶、Rho激酶和钙通道有关。

微动脉；乙醇；激酶；钙通道；血管平滑肌

酒主要成分是乙醇，随着生活水平的提高，全球饮酒人数呈递增趋势，而乙醇对人类健康的影响也受到越来越多的关注，作为心脑血管疾病的诱因之一，乙醇已成为近年来研究的热点。已有研究证明适量饮酒可以降低冠心病的死亡率[1-2]，在高血压的模型大鼠中，低剂量的乙醇可以降低血压[3]；乙醇可以引起家兔胸主动脉舒张，而这种舒张作用可能与血管平滑肌细胞肌质网Ca2+的释放和胞外Ca2+的内流有关[4]。前期研究表明：长期大量饮酒可以改变大鼠冠状动脉肌源性的反应，表现出对硝普钠和吡那地尔舒张作用的减弱，对血栓素A2(TXA2)受体激动剂U46619、K-IR通道抑制剂BaCl2、K-Ca通道抑制剂四乙胺(TEA)的收缩反应敏感性增加[5]，但缺乏急性酒精的刺激对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环影响的研究。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中p38MAPK与血管舒缩反应的调节有着密切的关系，其抑制剂SB239063能在磷酸化水平阻断生物信号转导；细胞外信号调节激酶(ERK)在血管的发生发展过程中发挥重要的作用[6]，其抑制剂PD98059可以抑制ERK的上游激酶MEK；Rho激酶与细胞有丝分裂、骨架调整、细胞收缩等一系列生命活动现象有关，Y27632是选择性的Rho激酶抑制剂，通过与GTP结合竞争性的抑制Rho激酶的活性[7]，使平滑肌松弛。乙醇引起的冠状动脉环的收缩是否与以上激酶有关，国内外尚未见报道。

钙通道普遍存在于各种组织中，是控制细胞外Ca2+跨膜内流的主要途径，胞外Ca2+的内流是兴奋-收缩耦联和兴奋-分泌耦联的关键环节，而对于乙醇引起的大脑中动脉环的收缩与Ca2+有无关系，需要进一步的证明。

本实验拟采用离体血管环的实验方法，观察在静息状态下乙醇对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉肌源性的反应；在不同预收缩剂基础上，乙醇对各微动脉的收缩作用及其差异性；在预收缩基础上，SB239063、PD98059、Y27632对乙醇引起的冠状动脉环收缩作用的影响；在预收缩基础上，硝苯地平对乙醇引起的大脑中动脉环收缩作用的影响。

1　材料与方法

1.1药品与试剂乙醇购自天津市大茂化学试剂厂，TXA2受体激动剂U46619、内皮素(ET)、SB239063、PD98059、Y27632均购自Sigma公司。正常生理平衡液PSS： NaCl 144 mmol/L，KCl 5.8 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L；含60 mmol/L KCl PSS：NaCl 89.8 mmol/L，KCl 60 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L；含39 mmol/L KCl PSS：NaCl 110.8 mmol/L，KCl 39 mmol/L，MgCl21.2 mmol/L，CaCl22.5 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L，HEPES 5 mmol/L，试剂均为市售分析纯。

1.2实验动物健康雄性SD大鼠，体重220 g～250 g，3个月龄，购自山西医科大学实验动物中心，在药理教研室动物房喂养2周后方可进行实验。

1.3实验仪器与设备离体微血管环张力测定仪，购自丹麦DMT公司；PowerLab Chart 生物信号采集记录系统，购自澳大利亚 AD 仪器；恒温水浴箱，购自成都泰盟科技有限公司；体视显微镜，购自江西凤凰体视显微镜XTL-165-VT连续变倍45×/90×/180×；PHS-3C pH 计，购自上海雷磁公司；赛多利斯 BS 124 S 精密电子天平，购自德国 Sartorius 公司；显微外科手术器械，购自上海医疗器械(集团)有限公司。

1.4离体微动脉环的制备取大鼠，断头处死，立即取出心脏置于4 ℃的PSS液中，迅速挤压心脏，直至液体清亮无血；打开腹腔，沿腹主动脉取出两侧肾脏；打开颅骨，在头颅下轻轻取出大脑组织；取出的组织均放在提前在冰箱中预冷的PSS液中以备用。在显微镜下，用显微器械轻轻剖离周围组织，分别分离出大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉，将游离的动脉剪成2 mm长的动脉环，放入含有5 mL预冷的PSS液浴槽中，并用钢丝固定在DMT传感器上。

1.5实验方法①动脉环在浴槽中维持1 h，在此过程中，持续通入100%的氧气并给予恒温，每隔15 min用恒温的PSS液更换1次，在实验开始前，用含有60 mmol/L KCl的PSS液连续刺激血管，当两次血管收缩幅度相差不超过10%时，认为血管反应良好，可正式开始实验。②静息状态下，在正常的PSS液中累计加入0.1%、0.3%、1%的乙醇，观察不同浓度乙醇对大鼠微动脉环张力的影响。③在不同的预收缩剂(0.3 μmol/L U46619、39 mmol/L KCl、0.000 3 μmol/L ET)基础上，观察不同浓度乙醇对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环张力的影响，并比较其有无组织间差异性。以60 mmol/L KCl对微动脉的收缩幅度为100%，计算在不同预收缩剂基础上不同浓度乙醇对微动脉环的收缩幅度。④在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，预孵不同激酶抑制剂SB239063、PD98059、Y27632，观察不同激酶抑制剂对不同浓度乙醇所致的冠状动脉环收缩作用的影响，以60 mmol/L KCl对冠状动脉环的收缩幅度为100%，计算预孵不同激酶抑制剂后，不同浓度乙醇对冠状动脉环的收缩幅度。⑤在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，预孵硝苯地平，观察对不同浓度乙醇所致的大脑中动脉环收缩作用的影响，以60 mmol/L KCl对大脑中动脉环的收缩幅度为100%，计算预孵硝苯地平后，不同浓度乙醇对大脑中动脉环的收缩幅度。

2　结　果

2.1不同浓度乙醇对大鼠微动脉环静息张力的影响在静息状态下，向浴槽中累计加入0.1%、0.3%、1%的乙醇，对大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的张力并没有显著的影响。

2.2在U46619(0.3 μmol/L)预收缩基础上乙醇对微动脉的收缩作用在U46619 (0.3 μmol/L)预收缩基础上，大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的张力随着乙醇浓度(0.1%、0.3%、1%)的升高而增高。以60 mmol/L KCl对各微动脉的收缩幅度为100%，在U46619预收缩基础上，不同浓度乙醇对大鼠冠状动脉环的收缩幅度分别为(8.34±1.78)%、(28.76±2.99)%、(78.27±17.11)%，对肾动脉环的收缩幅度分别为(6.46±1.37)%、(12.43±3.19)%、(37.81±6.99)%，对大脑中动脉环的收缩幅度分别为(11.46±3.40)%、(33.41±8.49)%、(87.93±8.40)% 。以乙醇对冠状动脉环的收缩幅度为对照组，0.3%、1%的乙醇在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上对肾动脉环的收缩差异有统计学意义(P<0.05)。详见图1。

注：与对照组比较，★P<0.05。

2.3在KCl(39 mmol/L)预收缩基础上乙醇对微动脉环的收缩作用在39 mmol/L KCl的预收缩基础上，大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的张力随着乙醇浓度(0.1%、0.3%、1%)的增高而增高，以60 mmol/L KCl 对微动脉的收缩幅度为100%，在KCl预收缩基础上，不同浓度乙醇对大鼠冠状动脉环的收缩幅度分别为(5.93±0.87)%、(17.50±4.42)%、(36.74±2.02)%。对肾动脉环的收缩幅度分别为(3.03±2.28)%、(9.52±4.55)%、(25.16±2.26)%。对大脑中动脉环的收缩幅度分别是(2.79±0.75)%、(16.32±5.61)%、(41.55±7.84)%。以乙醇对冠状动脉环的收缩幅度为对照组，在39 mmol/L KCl预收缩基础上，0.3%、1%的乙醇对肾动脉环的收缩幅度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，0.1%的乙醇对大脑中动脉环的收缩幅度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

注：与对照组比较，★P<0.05。

2.4在ET(0.000 3 μmol/L)预收缩基础上乙醇对微动脉的收缩作用在0.000 3 μmol/L ET 的预收缩基础上，大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的张力随着乙醇浓度(0.1%、0.3%、1%)的增高而增高，以60 mmol/L KCl对微动脉的收缩幅度为100%，在ET预收缩基础上，不同浓度乙醇对大鼠冠状动脉的收缩幅度分别为(9.36±4.02)%、(19.08±7.91)%、(63.05±8.58)%，对肾动脉环的收缩幅度分别为(3.65±1.46)%、(11.98±3.32)%、(26.69±5.77)%，对大脑中动脉环的收缩幅度分别为(11.00±1.97)%、(25.86±5.76)%、(60.91±6.13)%。以乙醇对冠状动脉环的收缩幅度为对照组，在0.000 3 μmol/L ET预收缩基础上，0.1%、1%的乙醇对肾动脉环的收缩幅度与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见图3。

注：与对照组比较，★P<0.05。

2.5SB239063对U46619(0.3 μmol/L)预收缩基础上不同浓度乙醇所致的冠状动脉环收缩作用的影响以60 mmol/L KCl对冠状动脉环的收缩幅度为100%，在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，0.1%、0.3%、1%的乙醇所致冠状动脉环的收缩幅度分别为(10.92±6.41)%、(24.87±5.38)%、(70.97±22.57)%，预孵3μmol/LSB239063时，可以抑制0.3%乙醇对冠状动脉环的收缩(P<0.05)，其收缩百分比为(10.16±7.06)%。SB239063对0.1%、1%乙醇所致冠状动脉环的收缩无显著影响。详见图4。

注：与对照组比较，★P<0.05。

图4SB239063对U46619预收缩基础上不同浓度乙醇所致冠状动脉环收缩作用的影响

2.6PD98059对U46619(0.3 μmol/L)预收缩基础上不同浓度乙醇所致冠状动脉环收缩作用的影响 以60 mmol/L KCl对冠状动脉环的收缩幅度为100%，在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，0.1%、0.3%、1%的乙醇所致冠状动脉环的收缩幅度分别为(9.54±7.59)%、(23.12±13.77)%、(51.17±17.86)%，预孵3 μmol/L PD98059时，可以抑制0.1%、0.3%乙醇对冠状动脉环的收缩作用(P<0.05)，其收缩百分比分别为(0.25±3.08)%、(4.24±8.45)%，PD98059对1%乙醇所致冠状动脉环的收缩无显著影响。详见图5。

注：与对照组比较，★P<0.05。

图5PD98059对U46619预收缩基础上不同浓度乙醇所致冠状动脉环收缩作用的影响

2.7Y27632对U46619(0.3 μmol/L)预收缩基础上不同浓度乙醇所致冠状动脉环收缩作用的影响以60 mmol/L KCl对冠状动脉环的收缩幅度为100%，在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，0.1%、0.3%、1%的乙醇对冠状动脉环的收缩幅度分别为(7.10±2.52)%、(28.46±18.49)%、(68.34±12.07)%。预孵1 μmol/L Y27632时，可以抑制0.1%、1%的乙醇对冠状动脉环的收缩作用(P<0.05)，其收缩百分比分别为(0.61±0.20)%、(33.33±12.49)%，Y27632对0.3%乙醇所致冠状动脉环的收缩无显著影响。详见图6。

注：与对照组比较，★P<0.05。

图6Y27632对U46619预收缩基础上不同浓度乙醇所致冠状动脉环收缩作用的影响

2.8硝苯地平对U46619预收缩基础上乙醇所致的大脑中动脉环收缩作用的影响以60 mmol/L KCl对大脑中动脉环的收缩幅度为100%，在0.3 μmol/L U46619预收缩基础上，0.1%、0.3%、1%的乙醇对大脑中动脉环的收缩幅度分别为(12.30±8.73)%、(32.16±16.76)%、(80.19±20.15)%，预孵硝苯地平0.3 μmol/L时，可以抑制0.1%、0.3%、1%的乙醇对大脑中动脉的收缩作用(P<0.05)，其收缩百分比分别为(2.30±1.29)%、(11.52±8.26)%、(55.42±21.98)%。详见图7。

注：与对照组比较，★P<0.05。

图7硝苯地平对U46619预收缩基础上乙醇所致的大脑中动脉环收缩作用的影响

3　讨　论

本实验观察不同浓度乙醇在不同预收缩剂基础上对不同组织来源微动脉的收缩作用，结果表明：在预收缩剂基础上，大鼠冠状动脉、肾动脉、大脑中动脉环的张力随着乙醇浓度的增高而增高，并具有组织差异性，且该收缩可能与丝裂原活化蛋白激酶、Rho激酶和钙通道有关。

U46619作为血栓素A2受体激动剂，可以引起大鼠不同脏器微动脉环收缩，前期研究证明：U46619引起的微动脉收缩与一氧化氮(NO)和前列环素有关[8]，乙醇可以加强U46619 引起的微动脉的收缩作用，也可能与NO和前列环素有关，而NO和前列环素是血管内皮细胞生成和释放的主要舒张血管物质。在体外培养内皮细胞发现，乙醇可以降低其生存率，增加凋亡比例，破坏内皮细胞的正常形态[9]，国外已有报道，通过长期乙醇的摄入，可以破坏NO介导的脑小动脉的舒张作用[10]，因此进一步的血管环实验探讨在预收缩基础上乙醇引起的微动脉的收缩是否与NO和前列环素有关。在血管平滑肌细胞上存在多种类型的离子通道，其中钾通道分布最广泛，本实验观察到在KCl预收缩基础上乙醇可以引起微动脉收缩，说明乙醇可以加强KCl引起的膜去极化的作用，这可能与乙醇阻断血管平滑肌细胞上某些K+通道的作用有关。内皮素是血管内皮生成的缩血管物质，在心血管动态平衡中起关键作用，其缩血管效应与钙通道的开放和磷脂酶活化有关[11]，乙醇对ET引起的微动脉收缩具有协同作用，该协同作用可能与激活某些钙通道有关。有研究发现：乙醇可以引起胸主动脉的收缩，而这种收缩作用是通过增加细胞内钙离子来实现的，与氧化还原反应和环氧酶依赖途径有关[12]。本实验在预孵钙通道阻断剂硝苯地平时，可以抑制乙醇所致的大脑中动脉的收缩作用，更加证实了这一观点。

血管平滑肌细胞在调节血管舒缩方面起到很重要的作用，而乙醇可以通过抑制MAPK来防止大鼠胸主动脉平滑肌细胞的增殖分裂[13-14]，MAPK在调节平滑肌细胞的生长过程中扮演关键的角色。本实验中选用MAPK家族中p38MAPK、ERK的抑制剂SB239063、PD98059，观察到SB239063可以抑制0.1%的乙醇引起的冠状动脉收缩，PD98059可以抑制0.1%、0.3%的乙醇引起的冠状动脉的收缩；Rho激酶在MAPK系统的上游，自身活化可以激活MAPK，Rho相关激酶ROCK的抑制剂之一Y27632可以抑制0.1%、1%的乙醇对冠状动脉环的收缩作用。由此可以推断乙醇引起的冠状动脉环的收缩作用可能与MAPK家族、Rho相关激酶有关。

乙醇在心脑血管系统中的作用机制比较复杂，本实验只是在血管环水平简单观察乙醇对微动脉的收缩作用及其与激酶抑制剂的作用，其具体的收缩机制还需要在细胞水平和分子水平上做进一步的证明。近年来，全球饮酒人数越来越多，乙醇对人类健康的危害也受到重视，探讨乙醇的作用机制变得愈发重要。

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(本文编辑郭怀印)

山西医科大学(太原 030001)

张明升，E-mail：18335170902@139.com

R329R256.2

Adoi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．14．013

1672-1349(2016)14-1606-05

2015-10-25)