MicroRNA-134通过下调叉头框蛋白M1/人基质金属蛋白酶2表达抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭

丁云，陆肖玮

（江苏省无锡市妇幼保健院 乳腺科，江苏 无锡 214002）



MicroRNA-134通过下调叉头框蛋白M1/人基质金属蛋白酶2表达抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭

丁云，陆肖玮

（江苏省无锡市妇幼保健院 乳腺科，江苏 无锡 214002）

目的探讨microRNA-134（miR-134）在乳腺癌中的表达及其影响乳腺癌迁移、侵袭能力的分子机制。方法选取2013年1月-2015年2月于本院乳腺病科行手术切除并经病理检查证实的乳腺导管内原位癌组织30例、乳腺浸润性导管癌组织35例及正常乳腺组织15例。通过实时定量聚合酶链式反应法分别检测miR-134在肿瘤和正常乳腺组织中的表达，统计分析miR-134表达与患者临床特征间的相关性；通过miR-134模拟物转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，采用细胞划痕愈合试验评价过表达miR-134对细胞迁移能力的影响，采用Transwell侵袭小室试验评价过表达miR-134后MDA-MB-231细胞侵袭能力的变化。通过免疫组织化学染色检测miR-134与下游潜在靶点叉头框蛋白M1蛋白表达关系，实时定量聚合酶链式反应、蛋白免疫印迹检测转染miR-134模拟物后其下游潜在靶点叉头框蛋白M1及下游效应分子人基质金属蛋白酶2的表达变化。结果miR-134在正常乳腺组织、乳腺导管内原位癌组织及乳腺浸润性导管癌组织中的表达量依次降低（P＜0.05）。乳腺癌组织中低水平的miR-134与肿瘤淋巴结转移及高TNM分期显著相关（P＜0.05）；在体外试验中，过表达miR-134能够显著降低MDA-MB-231细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.05）；免疫组织化学染色结果证实miR-134与叉头框蛋白M1蛋白的表达呈负相关关系（P＜0.05）；实时定量聚合酶链式反应及蛋白免疫印记结果显示，过表达miR-134后可显著抑制乳腺癌细胞中叉头框蛋白M1及人基质金属蛋白酶2的表达水平（P＜0.05）。结论miR-134在乳腺癌组织中表达下调，miR-134可能通过下调叉头框蛋白M1/人基质金属蛋白酶2的表达来抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。

MicroRNA-134；乳腺癌；叉头框蛋白M1；人基质金属蛋白酶2；迁移；侵袭

在我国，乳腺癌是严重危害女性身体健康的公共卫生问题［1］。乳腺癌病理分型复杂，部分侵袭性较高的病理类型患者治疗难度大，易发生淋巴结及远处器官转移，预后较差［2］。因此，寻找能够抑制乳腺癌细胞侵袭能力的分子治疗靶点对提高乳腺癌治疗效果，延长乳腺癌患者生存时间具有重要意义。

微小RNA（microRNA，以下简称：miR）是一类长约19～24个核苷酸的非编码单链短RNA［3］。肿瘤生物学研究成果表明，miR-134能通过抑制包括PAK2［4］、KRAS［5］及WWOX［6］在内多的多个癌基因的表达而实现抗肿瘤效应。目前，miR-134在乳腺癌中的临床意义及生物学功能尚不清楚。

本研究通过检测miR-134在不同病理类型的乳腺癌组织中的表达及对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移、侵袭能力的调控作用，研究miR-134在乳腺癌转移中的临床意义及作用机制，为乳腺癌特别是转移性乳腺癌的分子诊断与靶向治疗提供一定的理论依据。

1　资料与方法

1.1临床标本及主要试剂

选取2013年1月-2015年2月于江苏省无锡市妇幼保健院乳腺科行手术切除并经病理检查证实的乳腺导管内原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）组织30例、乳腺浸润性导管癌（invasive breast ductal carcinoma，IBDC）组织35例及正常乳腺组织15例。所有入组患者平均年龄（49.7±3.1）岁。标本切除后行多点取材，分别保存于4%多聚甲醛溶液及液氮当中。Trizol试剂及LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒购自北京天根生物科技有限公司，miR-134qRT-PCR引物试剂盒、miR-134模拟物及阴性对照模拟物均购自广州锐博生物科技有限公司；叉头框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）引物（正向引物5'-GGGCGCAC GGCGGAAGATGAA-3'；反向引物5'-CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC-3'），人基质金属蛋白酶2（human matrix metalloproteinase 2，MMP-2）引物（正向引物5'-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3'；反向引物 5'-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3'）及β-actin引物（正向引物 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'）由上海升工生物科技有限公司合成。基质胶购自美国BD公司，Transwell小室购自美国康宁公司。兔抗人FOXM1多克隆抗体（ab83097）、兔抗人MMP-2多克隆抗体（ab37150）及鼠抗人β-actin单克隆抗体（ab6276）购自美国Abcam公司。乳腺癌MDA-MB-231由本实验室自存。RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量试剂盒及增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒均购自美国密理博公司。

1.2RNA提取及qRT-PCR

采用Trizol试剂通过苯酚-氯仿抽提法提取组织及MDA-MB-231细胞中总RNA。按RT-PCR试剂盒说明书配制逆转录反应体系，每反应管内加入500 ng RNA，通过miR-134特异性RT-PCR引物反转录miR-134，采用Oligo-dT引物法逆转录FOXM1、MMP-2及β-actin mRNA。反转录结束后以2μl cDNA进行实时定量荧光聚合酶链式反应，按2-ΔΔCT法计算miR-134及FOXM1、MMP-2及β-actin相对表达量。

1.3细胞转染

MDA-MB-231细胞培养于含10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的 1×改良 Eagle培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养基中，稳定传代2～3代后通过胰酶消化细胞并接种于六孔板中，接种密度以贴壁后融合度在50%左右为准。按LipofectamineTM2000及锐博模拟物转染说明书，按终浓度100 nmol/孔，分别向MDA-MB-231细胞中转染miR-134模拟物及空白对照组模拟物。转染4 h后更换为含10%FBS的完全培养基。

1.4细胞划痕愈合试验

取转染24 h后的MDA-MB-231细胞培养于6孔板中过夜培养至融合度90%以上。吸除原有培养基，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液洗涤细胞两遍，使用100μl枪头制作细胞划痕后使用PBS溶液洗去残余细胞，使用含5%血清的1×DMEM培养基培养细胞48 h，使用倒置显微镜观察细胞划痕愈合情况。

1.5Transwell侵袭小室

用1×DMEM培养基稀释基质胶，按100μl每孔包被Transwell小室底膜上室面。收集转染48 h后的MDA-MB-231细胞，以无血清DMEM培养基重悬后调整细胞密度为1×105/ml，按250μl每孔接种于 Transwell小室上室中，24孔板内每孔加入750μl含10%血清的DMEM培养基。培养箱内培养24 h后弃去上室内培养基，PBS洗涤2遍后采用4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，棉棒擦去上室面残余细胞，在显微镜下计数下室面细胞数量。

1.6免疫组织化学染色

将组织标本经脱水、石蜡包埋处理，自动切片机制作4μm组织切片，再经二甲苯及梯度酒精脱蜡、水化，于pH 6.0枸橼酸缓冲液进行抗原热修复；3%过氧化氢H2O2水溶液阻断内源性过氧化物酶活性；10%山羊血清封闭滴加兔抗人FOXM1抗体（1∶100），4℃孵育过夜；洗去多余一抗后，加生物素标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min；洗去残余未结合二抗，滴加辣根过氧化物酶-链酶卵白素复合物进行反应，二氨基联苯胺显色、苏木素复染，常规脱水、透明、中性树胶封片。每张切片在高倍镜（×400）下随机选取10个视野，按以下标准单独阅片、评分：染色强度评分：0分：阴性；1分：弱阳性；2分：中度阳性；3分：强阳性。阳性肿瘤细胞百分比评分：阳性细胞≤5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；75%为4分。每视野评分=染色强度评分×阳性肿瘤细胞百分比评分，切片的最终评分为10个视野的平均得分。

1.7蛋白免疫印迹法（Western blot）

收集转染72 h的MDA-MB-231细胞，使用RIPA裂解液裂解细胞，BCA法测定总蛋白浓度。每样本取50μg总蛋白进行垂直电泳分离，采用湿转法进行转膜后以1∶1 000稀释的FOXM1、MMP-2及β-actin一抗结合相应目的蛋白，以1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔或羊抗鼠二抗结合一抗，ECL法发光检测蛋白相对表达量。

1.8统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1乳腺癌组织中miR-134的表达变化

通过qRT-PCR检测发现，与正常乳腺组织比较，DCIS组织中miR-134的相对表达量为（0.475± 0.031），而IBDC组织中表达则更低仅为（0.281± 0.147）。对两组结果进行统计学分析证实，miR-134在正常乳腺组织、DCIS组织及IBDC组织中的表达水平依次降低（F=3.841，P=0.037）。提示miR-134的表达量与乳腺癌侵袭能力相关。见图1。

2.2乳腺癌组织中miR-134表达与患者临床病理特点间的相关性

笔者将65例患者的临床数据和病理诊断资料进行二分类后，分别计算miR-134在不同特征分类下的相对表达量。存在肿瘤淋巴结转移及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）的患者乳腺癌组织中miR-134的表达量更低。提示miR-134在调控乳腺癌侵袭过程中可能具有一定作用。见附表。

图1　miR-134在乳腺癌及正常乳腺组织中的表达

附表　miR-134表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系（n=65±s）

附表　miR-134表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系（n=65±s）

注：1）与存在淋巴结转移组比较，P＜0.05；2）与III+IV期比较，P＜0.01

2.3miR-134对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响

通过在MDA-MB-231细胞中转染miR-134模拟物过表达miR-134后，采用划痕愈合试验证明过表达miR-134能够显著抑制乳腺癌细胞的迁移（42.93±4.81）vs（70.96±4.33）（t=9.203，P=0.007）。进一步的Transwell侵袭小室检测结果表明过表达miR-134也能够抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力（19.16±1.78）vs（33.41±2.15）（t=8.727，P=0.009）。见图2。

2.4miR-134靶向下调MDA-MB-231细胞中FOXM1表达

FOXM1是近年来新发现的一种肿瘤转录激活因子。通过生物信息学数据库检索发现，FOXM1是miR-134的潜在靶点，进一步的体外研究结果表明在MDA-MB-231细胞内过表达miR-134能够显著下调 FOXM1 mRNA（1.000±0.000）vs（0.371± 0.018）（t=34.487，P＜0.001）的表达。除此之外，笔者在乳腺癌组织标本中也证实miR-134和FOXM1蛋白表达呈显著负相关 ［DCIS组：（8.785±1.032）vs（4.371±1.214）（t=2.401，P=0.031）；IBDC组：（12.026±3.741）vs（6.128±1.306）（t=2.583，P= 0.028）］，提示miR-134对FOXM1的表达具有负向调控作用。MMP-2是基质金属蛋白酶家族重要成员之一，对多种肿瘤细胞的侵袭、转移具有促进作用，既往研究表明，FOXM1能够促进MMP2的转录以提高细胞中MMP-2的表达水平，笔者的研究证实过表达miR-134可以下调MMP-2的表达（1.000± 0.000）vs（0.412±0.033）（t=30.024，P＜0.001）。见图3、4。

图2　过表达miR-134对MDA-MB-231细胞迁移及侵袭能力的影响

图3　miR-134与FOXM1表达相关性

图4　过表达miR-134对MDA-MB-231细胞FOXM1及MMP-2表达的影响

3　讨论

乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤。乳腺癌病理类型复杂，肿瘤异质性高［7］，乳腺癌的淋巴结及远处器官转移是限制患者治疗效果及预后的主要因素之一。近年来，microRNA在乳腺癌侵袭转移过程中发挥了重要的调控作用。例如，miR-99家族能通过抑制TGF-β/SMAD3通路的活化来抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力［8］。

miR-134是近年来新发现的一种具有多种生物学功能的microRNA。神经生物学研究表明，在脑神经组织缺血再灌注过程中，高水平的miR-134能够通过下调Bcl-2的表达促进神经细胞凋亡［9］。而在包括肾癌、骨肉瘤在内的多种人类恶性肿瘤中miR-134都呈现低表达趋势并与肿瘤恶性生物学行为相关，提示miR-134可能是一种具有抑癌作用的microRNA［10-11］。

在本研究中，笔者通过检测证实，乳腺癌中miR-134表达水平显著降低。更重要的是，与乳腺导管内原位癌组织比较，侵袭性较高的IBDC组中的miR-134表达量更低。同时，笔者通过分析不同临床病理特征分类下miR-134的表达量发现，miR-134低表达与乳腺癌患者淋巴结转移及高TNM分期密切相关。上述结果提示，miR-134对肿瘤侵袭、转移可能具有一定的抑制作用。在体外，笔者通过基因转染过表达miR-134后采用细胞划痕愈合试验和Transwell侵袭小室试验证实过表达miR-134能够抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，在微观上阐明了miR-134对乳腺癌侵袭转移的抑制作用。

FOXM1是一种重要的转录因子，由于其在多种人类恶性肿瘤中都高表达，因而其具有重要的肿瘤靶向治疗价值［12］。包括miR-204［13］、miR-370［14］及miR-877［15］在内多个microRNA都能通过下调FOXM1的表达抑制肿瘤进展。本课题中，笔者通过生物信息学检索发现，FOXM1也是miR-134的下游靶点之一。在体外试验中，笔者在MDA-MB-231细胞中的研究发现，过表达miR-134能够显著降低FOXM1的表达水平，提示FOXM1是miR-134在乳腺癌细胞中的有效靶点。基质金属蛋白酶是肿瘤细胞发生侵袭转移的直接效应分子，笔者通过文献检索［16］发现，FOXM1能够结合在MMP-2的启动子区域并促进其转录激活。笔者通过qRT-PCR及Western blot检测证实，转染miR-134在下调FOXM1的同时也能够降低MMP-2的表达。因而，笔者初步推断miR-134抑制乳腺癌细胞侵袭时通过抑制FOXM1/MMP-2表达实现的。

综上所述，miR-134在乳腺导管癌组织中表达显著降低。miR-134可能通过下FOXM1/MMP-2的表达来抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。

［1］邱秀娟，成芳，高俊.中国人群FGFR2基因多态性与乳腺癌易感相关性研究的Meta分析［J］.中华肿瘤防治杂志，2015，22（3）:227-234.

［2］刘荫华，高国璇.转移性乳腺癌外科手术应用价值及选择［J］.中国实用外科杂志，2015，35（7）:718-720.

［3］李超，涂康生，郑鑫，等.MicroRNA-218在肝细胞癌中的表达及功能［J］.南方医科大学学报，2013，33（8）:1127-1131.

［4］SHUANG T，WANG M，SHI C，et al.Down-regulated expression of miR-134 contributes to paclitaxel resistance in human ovarian cancer cells［J］.FEBS Lett，2015，589（20）:3154-3164.

［5］鲍美玲，钱健，张少波，等.MiR-134通过靶向调节KRAS抑制786-0肾透明细胞癌细胞上皮间质转化过程［J］.现代泌尿外科杂志，2014，19（6）:393-398.

［6］CHEN T J，GAO F，FENG S F，et al.MicroRNA-134 regulates lung cancer cell H69 growth and apoptosis by targeting WWOX gene and suppressing the ERK1/2 signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2015，464（3）:748-754.

［7］范雅文，张旭辉，张嵘，等.三阴乳腺癌的异质性及靶向治疗［J］.生物技术通讯，2015，26（3）:442-445.

［8］TURCATEL G，RUBIN N，EL-HASHASH A，et al.MIR-99a and MIR-99b modulate TGF-β induced epithelial to mesenchymal plasticity in normal murine mammary gland cells［J］.PLoS One，2012，7（1）:DOI:10.1371/journal.pone.0031032.

［9］HUANG W，LIU X，CAO J，et al.miR-134 regulates ischemia/reperfusion injury-induced neuronal cell deathby regulating CREB signaling［J］.J Mol Neurosci，2015，55（4）:821-829.

［10］LIU Y，ZHANG M，QIAN J，et al.miR-134 functions as a tumor suppressor in cell proli feration and epithelial-to-mesenchymal Transition by targeting KRAS in renal cell carcinoma cells［J］.DNA Cell Biol，2015，34（6）:429-436.

［11］BAO Y，PENG L，MA J，et al.Decreased miR-134 expression and its tumor-suppressive function in human osteosarcoma［J］. Genet Mol Res，2015，14（4）:16771-16781.

［12］XU X，CHEN W，MIAO R，et al.miR-34a induces cellular senescence via modulation of telomerase activity in human hepatocellular carcinoma by targeting FoxM1/c-Myc pathway［J］.Oncotarget，2015，6（6）:3988-4004.

［13］SUN Y，YU X，BAI Q.miR-204 inhibits invasion and epithelial-mesenchymal transition by targeting FOXM1 in esophageal cancer［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（10）:12775-12783.

［14］DUAN N，HU X，YANG X，et al.MicroRNA-370 directly targets FOXM1 to inhibit cell growth and metastasis in osteosarcoma cells［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（9）:10250-10260.

［15］HUANG X，QIN J，LU S.Up-regulation of miR-877 induced by paclitaxel inhibits hepatocellular carcinoma cell proliferation though targeting FOXM1［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（2）: 1515-1524.

［16］CHEN P M，WU T C，SHIEH S H，et al.MnSOD promotes tumor invasion via upregulation of FoxM1-MMP2 axis and related with poor survival and relapse in lung adenocarcinomas［J］.Mol Cancer Res，2013，11（3）:261-271.

（张蕾编辑）

MicroRNA-134inhibits cell migration and invasion by targeting forkhead box protein M1/human matrix metalloproteinase 2 in breast carcinoma

Yun Ding，Xiao-wei Lu
（Department of Breast Surgery，Wuxi Hospital for Maternal and Child Health Care，Wuxi，Jiangsu 214002，China）

Objective To investigate the expression ofmicroRNA-134（miR-134）in female breast carcinoma and its role for tumor cell migration and invasion.Methods Between January 2013 and February 2015，30 ductal carcinomain situ（DCIS）tissues，35 invasive breast ductal carcinoma（IBDC）tissues and 15 normal breast tissues were collected and investigated.The expressions ofmiR-134were detected by qRT-PCR.The relationship between miR-134and clinical features was analyzed by student-t test.miR-134mimics was transfected intoMDA-MB-231 cells.Wound healing assay and transwell assay were used to measure cell migration and invasion，respectively.The correlation betweenmiR-134and forkhead box protein M1，a potential target ofmiR-134，was analyzed by IHC staining.The expression changes of M1 and downstream effector molecules of humanMMP2in the potential target ofthe downstream potential target aftermicroRNA-134mimics infection were detected by qRT-PCR and western blotting.Results The expression ofMiR-134was significantly gradually decreased from normal breast tissue，in situ breast ductal carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast.The low expression ofMiR-134in breast cancer was significantly correlated with tumor lymph node metastasis and TNM stage（P＜0.05）.The migration and invasion of MDA-MB-231 cells capability were significantly reduced by over expression ofMiR-134in vitro.The expression ofmiR-134and the fork head boxM1was negative correlation confirmed by IHC（P＜0.05）.The results of qRT-PCR and western blotting showed over expression ofMiR-134could suppress breast cancer cells forkhead box proteinM1andMMP2expression level（P＜0.05）.ConclusionsMiR-134expression is down regulated in breast cancer tissues.miR-134may inhibit the migration and invasion of breast cancer cells by down regulating the expression ofM1/MMP2 2.

microRNA-134；breast cancer；fork head box protein M1；human matrix metalloproteinase 2；migration；invasion

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.009

1005-8982（2016）16-0043-06

2016-01-06

陆肖玮，E-mail：13815100097@126.com