五味子甲素衍生物联苯双酯的紫外防护作用及机制研究*

曹波，王娟娟，陈诗雅，路婷婷，陈虹，齐莉

（1.武警后勤学院，天津 300309；2.天津医科大学，天津 300070）



五味子甲素衍生物联苯双酯的紫外防护作用及机制研究*

曹波1，王娟娟2，陈诗雅1，路婷婷1，陈虹1，齐莉1

（1.武警后勤学院，天津 300309；2.天津医科大学，天津 300070）

目的探讨联苯双酯（DDB）对中波紫外线（UVB）的防护作用及其相关机制研究，为临床应用提供理论依据。方法DDB和维生素C对照检测五味子甲素衍生物DDB对超氧阴离子（O2-）的清除率。MTT法测定DDB、UVB对人永生化角质形成细胞（HaCaT）、人真皮成纤维细胞（FB）生长的影响及DDB对UVB的防护作用。通过Giemsa染色，从形态学上观察DDB对UVB损伤的防护作用。激光共聚焦观察活性氧簇（ROS）及检测其荧光强度。结果实验结果表明，相同浓度DDB具有强的清除O2-的能力；DDB对HaCaT、Fb细胞无毒性且可防护UVB损伤。Giemsa染色后，形态学上发现DDB可以明显抑制细胞的凋亡。DDB可抑制HaCaT细胞外ROS的生成。结论五味子甲素衍生物DDB对UVB有明显的防护作用，DDB作用机制是通过其抗氧化活性抑制UVB辐射引起的氧化应激及细胞凋亡等，起到紫外线防护作用，有望开发成为有效的抗氧化剂和紫外防护产品。

五味子甲素衍生物联苯双酯；机制研究；UVB

联苯双酯（dimethyl dicarboxylate biphenyl，DDB）是研究五味子过程中发现的一种重要的医药中间体［1］，它是一种单一木脂素化合物，可治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤引起转氨酶升高，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等生理功能［2］。

随着环境污染日渐加重，进而臭氧层破坏导致的紫外线损伤越来越严重，皮肤长期暴露在紫外线下可以引起皮肤损伤，出现皮肤光老化甚至出现皮肤癌变和其他皮肤病变［3］。皮肤接受过多的紫外线辐射，皮肤组织细胞会产生氧化应激，产生过量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），破坏细胞膜的完整性和细胞内的抗氧化系统，进一步引起细胞炎症、细胞凋亡及肿瘤的形成［4-5］。紫外线分为3个波段：长波紫外线（ultraviolet radiation A，UVA）320～400 nm；中波紫外线（ultraviolet radiation B，UVB）275～320 nm；短波紫外线（ultraviolet radiation C，UVC）230～275 nm。其中UVB又称作晒斑紫外线，其对皮肤的损伤最大［6-7］。预防紫外线光老化及有紫外线引起的皮肤病是重要措施，因此本实验对DDB的抗UVB作用进行了体外实验研究。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株人永生化角质形成细胞（HaCaT human keratinocyte cell line，HaCaT）和人黑色素细胞为四军医大学赠与，人真皮成纤维细胞（Human dermal fibroblasts，Fb）购自北京协和细胞库。

1.1.2主要试剂DDB由中国人民武装警察部队后勤学院生药学教研室提供，体外实验用DMSO配制。DMEM、RPMI1640购自天润善达公司，胎牛血清（FBS）为中国医学科学院血研所科技公司产品，二甲基亚砜（DMSO）、牛血清白蛋白（BSA）、溴化四氮唑蓝（MTT）均购自Sigma公司，胰酶（Trypsin）、Tris、Tris Base购自GIBECO公司，Triton X-100由香港FARCO公司提供，Giemsa染液为Serva公司产品。HE染液、一抗稀释液购自碧云天生物技术研究所，其他常规试剂及溶剂均由北京化学试剂研究所、北京化工厂及北京双环化学试剂厂提供。

1.1.3主要仪器MCO-AC型二氧化碳细胞培养箱购买于SANYO公司，JJT-900/1300超净工作台购买于北京半导体设备一厂，TS100型倒置显微镜购买于NiKon公司，CHK型光学显微镜和C-4040ZOOM型Olympus数码相机购买于Olympus公司，SZ-93自动双重纯水蒸馏器购买于上海亚荣生化仪器厂，HU-6150T型超声波清洗器购买于上海爱朗仪器有限公司，Adventurer万分之一电子天平购买于OHAUS公司，BIO-RAD MODEL680型酶标仪购买于BIO-RAD公司，LD5-2A常温离心机购买于北京医用离心机厂，UV-260型紫外-可见分光光度计购买于Shimadza公司，LDZX型立式压力蒸汽灭菌器购买于上海申安医疗器械厂，TL-2000MM-1型微量振荡仪购买于江苏天力医疗器械有限公司，SS01-01型紫外线治疗仪购买于上海西格玛技术有限公司，紫外辐照计购买于北京师范大学光电仪器厂。

1.2方法

1.2.1DDB对超氧阴离子（O2-）的体外清除作用试验原理：领苯三酚自氧化速率测定法即邻苯三酚本身无色，其在碱性条件下，可以自氧化成桔酚（桔色），加入抗氧化剂后可抑制其自氧化。在320 nm处检测邻苯三酚的吸光度值，从而得到DDB对邻苯三酚自氧化的抑制率［8］。

本实验采用维生素C（VC）作为阳性对照。DDB和VC用70%乙醇分别配成浓度0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.2 mg/ml、1.6 mg/ml、2.0 mg/ml和2.4 mg/ml。

以70%乙醇校正零点，在320nm处测定吸光度值，每个样品测3次，按公式①计算超氧阴离子的清除率。Q（%）=［Ao-（As-Ai）］/Ao×100%①。

1.2.2MTT法测定DDB、UVB对HaCaT、FB细胞生长的影响及DDB对UVB的防护作用取对数生长期细胞接种于96孔培养板内，每孔100μl（含1×104个细胞），置于37℃，5%二氧化碳温箱中培养。24 h后，移除培养液，加入50μl MTT溶液（1 mg/ml，PBS配置），37℃孵育4 h，移除上清，每孔加入150μl DMSO溶解甲簪颗粒，震荡溶解后，用酶标仪检测550 nm条件处测其光密度值（OD值），分别以不同浓度的的DDB或者不同辐射剂量的UVB为实验组，以溶剂对照组的细胞为对照组，用公式②计算药物对细胞的抑制率，并计算细胞存活率：细胞存活率=100-（对照组OD值-加药组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%②，每次实验重复3次。

取对数生长期的细胞同以上操作，后用中波紫外线（UVB）段紫外光疗仪辐射96孔板中细胞，辐射剂量132 mJ/cm2（辐射密度5.5 mW/cm2，辐射时间240 s），辐射完成后，模型组每孔加入100 ml DDB，对照组加入等量无血清DMEM，培养24 h，然后测量其OD值，同以上操作。

1.2.3Giemsa染色①收集及固定细胞，按上述方法处理好模型组和对照组后，用0.25%的胰酶消化HaCaT细胞，收集细胞，短时低速离心（1 000 r/min，5 min），弃上清，用pH7.4的PBS洗2次，离心（1 000 r/min，5 min）弃上清，以除去细胞悬液中的细胞碎片，每管加冷70%乙醇1 ml固定，将细胞轻吹成单个细胞，-20℃过夜。②然后离心收集HaCaT细胞，用PBS冲洗HaCaT细胞3次，室温避光，Giemsa染色应用液染色10 min。通过CHK型光学显微镜观察，Olympus数码相机照相。

1.2.4激光共聚焦观察活性氧簇（ROS）及检测其荧光强度取对数生长期HaCaT细胞，接种于直径60 mm平皿中（每孔放入1张圆形盖玻片），每孔加入1 ml（10 000个细胞）HaCaT细胞悬液。24 h后，给药组加入DDB，对照组加入含0.1%DMSO的空白培养基。2 h后，用PBS洗2遍，加入少许冷PBS（500μl），置于UVB辐射（132 mJ/cm2），辐射完成后，立即加入DCFH-DA（10μmol/L，二氯二氢荧光素双醋酸盐，免疫荧光染色剂）PBS溶液。放入37℃，二氧化碳培养箱中培养30min，通过激光共聚焦显微镜照相，通过荧光分光光度计检测其荧光强度。

1.3统计学方法

采用EXCEL软件和SPSS 13.0统计软件进行数据分析。实验数据均用均数±标准差（x±s）表示，各组之间均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1五味子甲素衍生物DDB对O2-的清除能力

图1为 DDB（0.4～2.4 mg/ml）和 VC（0.4～2.4 mg/ml）对O2-的清除率。结果表明相同浓度DDB具有清除O2-的能力，其清除能力弱于VC。经统计学分析可得出两者比较标准差为11.005，t=-6.566，查表P＜0.05，因此VC和DDB清除能力不同。

2.2UVB对HaCaT、Fb细胞的影响

UVB对细胞增殖的影响比较明显。如图2A所示，和无UVB辐射对照比较，UVB辐射量115.5 mJ/cm2、132 mJ/cm2和148.5 mJ/cm2分别降低HaCaT细胞存活率到（93±1.460）%、（45±4.526）%和（32±2.673）%（P＜0.05），呈剂量依赖性。如图2B所示降低Fb细胞存活率到（80±2.680）%、（72± 4.020）%和（66±3.550）%（P＜0.05），呈剂量依赖性。由于本实验细胞凋亡情况不可以太大，以辐射剂量132 mJ/cm2作为UVB细胞损伤模型辐射剂量。

2.3五味子甲素衍生物DDB对HaCaT、FB细胞生长的影响及其对UVB的防护作用

图1　DDB对?的清除率

图2　UVB对细胞增殖的影响

图3　DDB对细胞生长的影响及其对UVB的防护作用

MTT法结果显示，DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）HaCaT细胞存活率分别为（99±8.219）%，（103± 3.550）%，（111±7.496）%和（108±4.020）%，与正常对照组（79±1.770）%比较均有明显地增加，如图3A示；DDB浓度为1×10-4mol/L时，Fb细胞存活率为（98±4.640），存活率有所降低但不明显，DDB在（1×10-7～1×10-5mol/L）浓度范围时，Fb细胞存活率为（110±9.319）%、（104±2.615）%、（104± 7.810）%，与正常对照组比较有所增加，结果如图3B所示。实验结果表明DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）对HaCaT、Fb细胞无毒性，本次研究选择这个范围进行实验。DDB对UVB的防护作用如图3C所示，UVB辐射组（77±1.638）%与正常对照组比较，UVB辐射组显著性抑制了HaCaT细胞的活性；给药组DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）给药后，细胞存活率分别为 （90±3.740）%、（102±1.990）%、（104± 9.750）%和（118±3.090）%，与UVB辐射组比较显著提高。图3D所示，UVB辐射组（80±2.100）%与正常对照组比较，UVB辐射显著地抑制了Fb细胞的活性；给药组DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）给药后，细胞存活率分别为（100±10.220）%、（102± 6.715）%、（110±5.437）%和（101±5.771）%，与UVB辐射组比较显著提高。

2.4五味子甲素衍生物DDB对人黑色素细胞黑色素生产的影响

采用酶标仪在405 nm测定其吸光度值，间接反应出人黑色素细胞中黑色素生成量。从图4可以观察到DDB（1×10-6～1×10-4mol/L）给药组黑色素生成量分别为（62±1.870）、（77±0.981）和（39±1.090），与正常人黑色素细胞组比较明显降低。

2.5形态学观察五味子甲素衍生物DDB对Ha-CaT细胞的UVB防护作用

Giemsa染色如图5所示UVB辐射后，细胞产生凋亡，如箭头所指凋亡细胞。DDB（10-7mol/L）给药后，凋亡明显被抑制。

图4　DDB（1×10-6～1×10-4mol/L）对人黑色素细胞产生黑色素的影响

2.6五味子甲素衍生物DDB抑制HaCaT细胞外ROS的生成

图5　Giemsa染色法观察DDB对HaCaT细胞的UVB辐射的防护作用

图6　DDB对UVB辐射HaCaT细胞产生的ROS清除作用

图7　荧光法观察DDB对UVB辐射HaCaT细胞产生的ROS清除作用

本实验通过检测HaCaT细胞外总ROS水平，评价DDB的抗氧化作用。如图6结果表明，UVB辐射组（7.8±0.940）与正常对照组（14±0.790）比较，UVB辐射显著性升高了HaCaT细胞外总ROS水平；给药组与UVB对照组比较，DDB（1×10-4）给药（14±0.540）后，HaCaT细胞外总ROS水平没有显著降低，DDB（1×10-7～1×10-5mol/L）给药后，HaCaT细胞外总ROS水平分别为（12.1±0.380）、（11.4± 0.840）和（10.8±2.570），与UVB对照组比较均显著性降低。如图7所示，荧光法显示ROS产生量，UVB辐射组（图7B）较正常对照组（图7A）明显增多，而给药组（图7C、D、E、F）较UVB辐射组减少。

3　讨论

经研究表明，不同波段的紫外线，只有中波紫外线到达地面的量最大，而且它对人体的危害也最大。因此，针对中波紫外线对人体造成的危害的机制及该如何预防和治疗的研究是目前重点。联苯双酯是五味子甲素的一种衍生物，也是一种新型的药物，是治疗病毒性肝炎和药物性肝损伤引起转氨酶升高的常用药物，具有保护肝细胞，增加肝脏的解毒功能的药理作用。文献研究表明五味子甲素、乙素及丙素对H2O2对造成细胞的氧化损伤均具有一定的保护作用［9］。因此，在本次试验研究中，本实验对五味子甲素衍生物联苯双酯的抗氧化损伤进行了探索，实验结果发现，联苯双酯可以清除O2-，具有一定的抗氧化作用，从而起到防护UVB的作用。

波长短能量较高的UVB主要作用于表皮，Ha-CaT细胞占表皮细胞的90%以上，是构成表皮的主要细胞，可吸收辐射到皮肤的UVB的绝大部分；Fb细胞是皮肤真皮中的主体细胞；黑色素细胞是皮肤里的一种特殊细胞，它产生黑色素，传递给周围的HaCaT细胞，皮肤颜色的深浅根本取决于黑色素的含量［10］。因此本实验以HaCaT、Fb细胞为研究对象，同时对DDB抑制黑色素细胞的作用进行了研究，探讨DDB的抗UVB损伤的作用和DDB的美白效果。当 UVB辐射剂量为 30 mJ/cm2、60mJ/cm2及 90 mJ/cm2时，HaCaT细胞的抑制率分别为 3.86%、7.47%及11.67%［11］。本文通过MTT法得到细胞UVB损伤模型最佳UVB辐射剂量为132 mJ/cm2，HaCaT、Fb细胞细胞抑制率分别为55%和45%。在DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）浓度范围内，UVB辐射对HaCaT、Fb细胞的损伤可以得到明显的抑制，并且DDB可以抑制黑色素的产生。通过Giemsa染色形态学实验，观察对HaCaT细胞的UVB防护作用，直观的观察到DDB的UVB防护作用。

氧化应激是指活性氧簇（ROS）产生的细胞毒性反应。生命中ROS的有害影响和积累，一直被认为是导致机体衰老的重要原因之一，研究表明，ROS生成增加和脂质过氧化损伤使线粒体衰老，从而引起生命的衰老［12］。本文通过激光共聚焦观察HaCaT细胞外总活性氧簇（ROS）的水平及检测其荧光强度，可以观察到，DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）可以显著抑制UVB辐射引起的细胞凋亡。

综上所述，联苯双酯对UVB的防护作用的机制可能是通过抑制由UVB辐射引起皮肤氧化应激产生的ROS所产生的细胞毒性反应，并且可抑制UVB辐射引起的细胞损伤，因此联苯双酯可用于紫外线防护剂或者化妆品的开发应用。而联苯双酯对UVB的防护作用其他有可能的机制以及其应用于临床的效果还需进一步的研究。

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（张蕾编辑）

Protective effect of SchA derivant Dimethyl dicarboxylate biphenyl against damage of UVB irradiation and its mechanism*

Bo Cao1，Juan-juan Wang2，Shi-ya Chen1，Ting-ting Lu1，Hong Chen1，Li-Qi1
（1.Logistics University of People's Armed Police Force，TianJin 300309，China；2.Medical University Of Tianjin，Tianjin 300070，China）

Objective To evaluate the protective activity of SchA derivant DDB on the UVB-induced skin damage and explore its mechanism.Methods The Anti-oxidation activity against reactive oxygen species（ROS）including superoxide anion radical（O2-）was investigated.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to examine the effect of DDB or UVB on HaCaT and Fb cells'viability and its protective effect from UVB's damage.UVB-induced cells apoptosis was visualized with Giemsa stain.Anti-oxidative capacity of the drugs was evaluated by dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）assay.Results In this study，the topical application of DDB after UVB irradiation was found to decrease UVB-induced oxidation damage，the drug had a highly activity of superoxide anion radical（O2-）.Through MTT assay，we found that DDB was found had no damage to cells.Meanwhile，we also find that DDB can decrease human melanoma cell's production.Through Giemsa stain，we visualized that the drug can inhibite UVB induced HaCaT cell death.Conclusions In a word，DDB may be useful in antiphotoaging agents in the treatment of UVB irradiation.

SchA derivant dimethyl dicarboxylate biphenyl；mechanism；UVB

R932

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.005

1005-8982（2016）16-0023-06

2015-12-20

天津市应用基础与前沿技术研究计划（青年项目）（No：14JCQNFC10300）；武警后勤学院院级科学基金（No：WHM201308）；国家自然基金资助项目（No：81072964）

齐莉，E-mail：qili3017@sina.com，Tel：13920146924