白细胞介素8对高糖诱导的人脂肪间充质干细胞损伤的保护作用*

沈雷，沙峰，孙权，张鹏，孙石柱，张晓东，姚立杰，李静平

（齐齐哈尔医学院 解剖教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）



白细胞介素8对高糖诱导的人脂肪间充质干细胞损伤的保护作用*

沈雷，沙峰，孙权，张鹏，孙石柱，张晓东，姚立杰，李静平

（齐齐哈尔医学院 解剖教研室，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

目的探讨白细胞介素8（IL-8）对高糖诱导人脂肪间充质干细胞（hAdMSC）损伤的保护作用。方法含250 mmol/L葡萄糖的培养基建立细胞高糖模型；P65质粒转染人IL-8基因到hAdMSC为IL-8转染组，仅转染P65质粒者为P65对照组，在IL-8转染组中添加PD98059为Erk抑制剂组。利用MTT细胞增殖实验、ELISA或流式细胞技术检测各组hAdMSC增殖的光密度值（OD值）、Caspase-3、Erk或VEGF等蛋白的表达。结果与P65对照组比较，IL-8转染组hAdMSC增殖OD值明显升高，Caspase-3蛋白表达下降（P＜0.01）；IL-8转染组Erk蛋白活性和VEGF蛋白含量明显高于P65对照组（P＜0.01）；但与IL-8转染组比较，Erk抑制剂组hAdMSC增殖的OD值降低，Caspase-3蛋白表达升高（P＜0.01）。结论IL-8在高糖环境下，通过Erk通路，发挥对hAdMSC的保护作用。

高糖；白细胞介素8；人脂肪间充质干细胞；Erk通路

研究发现，全球糖尿病患者人数目前约为3.22亿人，到2035年将达到5.92亿［1］。中国人口老龄化问题日益严重，老年人糖代谢比较紊乱、机体功能减退，是糖尿病的好发人群［2］；高血糖会使体内活性氧等自由基大量增多，活跃的自由基造成体内细胞结构紊乱，活性和功能降低［3］，进而引发全身多种组织和器官发生严重的糖尿病并发症［4］。目前发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）具有来源广泛、免疫低、多分化性等优点，是治疗糖尿病血管、神经等复杂病变的首选种子细胞［5］。研究还发现，高糖环境会对移植的细胞、体内宿主细胞造成严重的损伤［6］，如何避免高糖损伤，是值得研究的科学问题。

宫颈癌细胞在缺氧刺激下会大量表达白细胞介素8（Interleukin-8，IL-8），IL-8会促进肿瘤细胞增殖、促进血管内皮细胞归巢和血管新生，达到抗缺氧的效果［7］，但是在糖尿病性高糖环境中，IL-8是否也会发挥抑制MSC损伤、促进MSC增殖研究却鲜见报道。结合文献报道，本研究拟以人IL-8修饰人脂肪间充质干细胞，既发挥IL-8保护细胞抗高糖损伤的作用，又能促进体内细胞归巢，对治疗糖尿病等缺氧性疾病具有重要意义。

1　材料与方法

1.1主要试剂和仪器

人脂肪间充质干细胞（human Adipose derived mesenchymal stem cells，hAdMSC）购于武汉普诺赛生物公司，以色列Bioind公司生产的BI胎牛血清，青链霉素和α-MEM培养基均购自美国Hyclone公司，人IL-8引物：正向5'-CTGGCTTATCTTACCATCAT-3'，反向5'-TCAAATACGGAGTGACGAA-3'，由大连宝生公司合成测序。DH5α大肠杆菌和P65质粒由本教研室提供，LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司，葡萄糖、MTT和PD98059均购自美国Sigma公司，小鼠抗人IL-8和小鼠抗人Erk/磷酸化Erk（P-Erk）抗体均购自美国Santa Cruz公司，人VEGF-ELISA试剂盒购自美国RD公司，Erk、P-Erk活性检测试剂盒购置Cell Signaling公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡双标试剂盒购置杭州碧云天生物公司，流式细胞分选仪（美国BD公司）。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养和分组hAdMSC用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养；在α-MEM培养基中添加250 mmol/L葡萄糖为hAdMSC高糖培养基。在高糖模型下，无任何刺激者为对照组，仅转染P65质粒者为P65对照组，P65质粒转染人IL-8基因到hAd MSC为 IL-8转染组，在 IL-8转染组中添加50μmol/L PD98059为Erk抑制剂组，正常条件下培养MSC者为正常对照组。

1.2.2IL-8基因稳定转染MSC稳定转染一般步骤为：培养3×105hAdMSC，采用LipofectamineTM3000试剂盒将P65IL-8重组质粒转染MSC。培养2 d后，用含300μg/ml G418的α-MEM培养液进行筛选，2周后收集阳性细胞，获得稳定转染IL-8的MSC，利用蛋白免疫印迹法（Western blot）实验进行鉴定［8］。

1.2.3Western blot检测人IL-8的表达裂解各组细胞，12 000 r/min，提取蛋白液，SAB法进行蛋白定量；凝胶电泳60 min后；转膜至硝酸纤维素薄膜；山羊血清封闭60min；再添加小鼠抗人IL-8（1∶150）等抗体，HRP标记山羊抗小鼠IgG（1∶200）；ECL试剂等步骤检测蛋白表达，Image-Pro Plus 6.0.1软件分析各蛋白条带的灰度值，计算蛋白相对灰度值，β-actin为内参对照。

1.2.4MTT法检测细胞增殖情况按hAdMSC分组情况，96孔板的每孔内接种2×104hAdMSC，用100μl的hAdMSC培养基培养48 h后，0.01mmol/L PBS清洗，每孔加入20μl 5 mg/ml的MTT，孵育4 h后，添加100μl DMSO，充分振荡，使用450 nm波长测定每个样品吸光度（OD值）。

1.2.5流式细胞技术实验检测各组细胞凋亡率按照实验分组情况，培养每组5×106hAdMSC，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞，0.01 mol/L PBS清洗，按照细胞凋亡双标试剂盒致使进行细胞标记后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6VEGF蛋白含量和P-Erk/Erk蛋白活性检测按照实验分组情况，培养5×107hAdMSC，0.01 mol/L PBS清洗，以含0.1%胎牛血清的hAdMSC高糖培养基，在37℃、5%二氧化碳条件下培养12 h，收集各组细胞的上清液，ELISA试剂盒进行检测VEGF含量，分别利用Erk/P-Erk活性检测试剂盒检测各组hAdMSC中P-Erk/Erk蛋白活性。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。每次试验至少重复3次。

2　结果

2.1IL-8的表达

P65对照组IL-8的表达与正常对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与P65对照组比较，IL-8转染组的IL-8蛋白相对含量提高1.679倍，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1和图1。

2.2IL-8对hAdMSC增殖和凋亡的影响

高糖环境下，IL-8转染组hAdMSC增殖的OD值是P65对照组的3.172倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而Erk抑制剂组的hAdMSC增殖的OD值则是IL-8组的0.571倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2A和表2；IL-8转染组的细胞凋亡率是高糖对照组的0.365倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而Erk抑制剂组的细胞凋亡率则是IL-8组的1.296倍，两者比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2B、2C和表2。

2.3各组hAdMSC的P-Erk/Erk和VEGF蛋白的表达

IL-8转染组P-Erk/Erk相对灰度值是P65对照组的1.313倍（P＜0.01）；Erk抑制剂组P-Erk/Erk相对灰度值是IL-8转染组的0.679倍（P＜0.01），见表3和图3A、3B；IL-8转染组VEGF蛋白含量是P65对照组的2.118倍（P＜0.01）；Erk抑制剂组VEGF蛋白含量是IL-8转染组的0.338倍（P＜0.01），见表3和图3C。

表1 各组hAdMSC表达的IL-8方差分析

图1　hAdMSC的IL-8蛋白表达

图2　IL-8对hAdMSC增殖和凋亡的影响

表2　各组hAdMSC增殖和凋亡的方差分析 （n=18，±s）

表2　各组hAdMSC增殖和凋亡的方差分析 （n=18，±s）

注：1）P65对照组与IL-8转染组hAdMSC增殖的OD值比较，P＜0.01；2）IL-8转染组与Erk抑制剂组hAdMSC增殖的OD值比较，P＜0.01；3）P65对照组与IL-8转染组hAdMSC凋亡率的比较，P＜0.01；4）IL-8转染组与Erk抑制剂组hAdMSC凋亡率的比较，P＜0.01

表3　各组hAdMSC的p-Erk/Erk相对灰度值和VEGF蛋白的方差分析 （n=24，±s）

注：1）P65对照组与IL-8转染组P-Erk/Erk相对灰度值比较，P＜0.01；2）IL-8转染组与Erk抑制剂组P-Erk/Erk相对灰度值比较，P＜0.01；3）P65对照组与IL-8转染组VEGF蛋白含量比较，P＜0.01；4）IL-8转染组与Erk抑制剂组VEGF蛋白含量比较，P＜0.01

图3　IL-8对各组hAdMSC表达P-Erk/Erk、VEGF蛋白的影响

3　讨论

糖尿病是严重的多系统多器官损伤的慢性疾病，YANG等在《N Engl J Med》撰文，认为糖尿病及心、肾、脑等部位的并发症是中国及其世界进步和发展的严重阻碍因素之一［9］，虽然各国均投入大量的人力、物力和财力进行糖尿病相关研究，但是，糖尿病及其并发症仍然是棘手的医学难题［9］。究其原因，主要是由于高血糖状态造成体内物质代谢紊乱，氧自由基增多，血管神经变性等改变［10］，因此，如果从内在因素考虑糖尿病及其并发症的形成和病理过程，有可能加大治疗效果。

间充质干细胞是一类存在于脂肪、骨髓和角膜等部位，具有多分化特性、多组织适应性、多来源途径的干细胞，由于其免疫性较低，移植MSC避免伦理问题的纠纷，成为细胞治疗的重要细胞［11］。近年来的研究发现，存在于人体脂肪组织的脂肪间充质干细胞，由于含量较多，易于获得，因此成为组织工程首先考虑的种子细胞。研究发现，AdMSC可以有效地促进血管新生，加速伤口愈合［12］，并发现，MSC表面表达多种趋化因子受体，CXCL12和CXC1等多种趋化因子，多招募MSC归巢具有重要作用［13］。2014年Science杂志报道，伤口周围巨噬细胞、中性粒细胞等细胞会释放大量IL-8等趋化因子，IL-8起到招募血管内皮细胞、成纤维细胞归巢，加速细胞外基质形成等作用，对伤口愈合具有积极作用［14］。但是，在糖尿病皮肤溃疡组织周围，由于高血糖导致细胞功能降低，IL-8等趋化因子释放大量减少，致使糖尿病皮肤溃疡迁延愈合甚至不愈合［14］。由此启发，如果外源性给与IL-8，有可能诱导细胞归巢，加速糖尿病并发症修复的速度。

本实验发现正常环境下，培养的MSC上清液中可以表达IL-8，与P65对照组比较，差异无统计学意义，也有研究发现，骨髓和骨膜等部位来源的MSC可以表达少量IL-8等因子［15］。进行转染IL-8的MSC上清液中IL-8含量增加，说明转染成功。

研究发现，与P65对照组比较，转染IL-8的hAdMSC能够高效表达 IL-8蛋白，IL-8转染组hAdMSC的细胞增殖OD值明显比缺氧对照组升高，IL-8转染组的细胞凋亡率比缺氧对照组降低，这提示，高糖环境下，IL-8能够与hAdMSC表面的CXCL1/2受体结合［15］，激活了相应信号通路。本研究以PD98059阻断Erk通路，发现Erk抑制剂组的细胞增殖OD值与凋亡率表达与IL-8转染组均呈现反向关系，Erk蛋白在IL-8转染组和Erk抑制剂组表达均较高；而与IL-8转染组比较，Erk抑制剂组P-Erk蛋白表达明显降低，证明IL-8通过Erk蛋白通路发挥对高糖诱导人脂肪间充质干细胞损伤的保护作用。ELISA研究发现，IL-8转染组VEGF蛋白表达均高于P65对照组，而Erk抑制剂组VEGF蛋白的表达则降低，这可能是由于IL-8与hAdMSC表面的受体结合，激活MAPK-Erk信号通路，导致VEGF基因表达，进而使VEGF和IL-6表达升高［16］，当然，IL-8也可以通过Akt通路促进细胞活化［7］，相关机制还需要深入研究。

综上所述，IL-8转染的hAdMSC可以发挥抗高糖导致的MSC损伤，对hAdMSC具有保护性作用。下一步将拟用高效液相色谱技术确定IL-8刺激hAdMSC的有效分泌因子，并建立糖尿病皮肤溃疡动物模型，观察IL-8联合MSC对该动物模型皮肤溃疡愈合作用，为开发IL-8等趋化因子的应用奠定实验基础。

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（张蕾编辑）

Protective effect of interleukin-8 on injury of human adipose derived mesenchymal stem cells induced by high glucose*

Lei Shen，Feng Sha，Quan Sun，Peng Zhang，Shi-zhu Sun，Xiao-dong Zhang，Li-jie Yao，Jing-ping Li
（Department of Anatomy，Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang 161006，China）

Objective To investigate the protective effect of interleukin-8（IL-8）on high glucose induced injury of human adipose derived mesenchymal stem cells（hAdMSC）induced by high glucose.Methods High glucose model with 250 mmol/l glucose medium was established.In IL-8 transfection group，human IL-8 gene was transfected into hAdMSC by p65 plasmid.In the control group，and P65 plasmid was transfected，and in Erk Inhibitor group，PD98059 was added into IL-8 transfection group.MTT cell proliferation assay，ELISA and flow cytometry was used to detect hAdMSC proliferation of the optical density（OD）or Caspase-3，Erk and VEGF protein.Results Compared with the p65 control group，OD of IL-8 transfection group was increased significantly and the proliferation of hAdMSC was increased，Caspase-3 protein expression was decreased，P＜0.01.Erk protein activity and VEGF protein in IL-8 transfected group were significantly higher than those in p65 control group，P＜0.01.But compared with the IL-8 group，OD of hAdMSC proliferation in Erk inhibitor group was decreased，expression of Caspase-3 protein was increased，P＜0.01.Conclusions In the high glucose environment，IL-8 plays a protective role for human adipose derived mesenchymal stem cells through the Erk signal pathway.

high glucose；interleukin-8；human adipose derived mesenchymal stem cells；Erk signal

R641

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.004

1005-8982（2016）16-0018-05

2015-12-14

国家自然科学基金项目（No：81541137）；黑龙江省教育厅指令科研课题（No：12541901）