谷氨酰胺通过PI3K/Akt信号通路对心肌细胞的缺氧保护作用

虎松艳　范丽梅　郭友峰

（1.广东食品药品职业学院；2.广东省妇幼保健院；3.广东省食品药品职业技术学校，广东广州510000）



谷氨酰胺通过PI3K/Akt信号通路对心肌细胞的缺氧保护作用

虎松艳1范丽梅2郭友峰3

（1.广东食品药品职业学院；2.广东省妇幼保健院；3.广东省食品药品职业技术学校，广东广州510000）

目的：谷氨酰胺对心肌细胞的缺氧保护作用及上游PI3K/Akt信号通路在其中的作用。方法：体外分离培养乳鼠心肌细胞，分为对照组、缺氧组和谷氨酰胺+缺氧组。采用MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡百分率，采用Western Blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax的表达情况，检测信号通路PI3K和Akt蛋白磷酸化水平。结果：与对照组比较，缺氧组的细胞增殖活性明显降低，凋亡蛋白Bax的表达明显增加。而随着培养时间的延长，缺氧心肌细胞与谷氨酰胺共培养组细胞活性呈上升趋势，24小时效果最明显，且Bcl-2蛋白表达增加，而Bax蛋白水平下降，PI3K和Akt蛋白磷酸化水平明显升高。结果：在缺氧情况下，谷氨酰胺通过激活PI3K/Akt信号通路抑制细胞的凋亡，提高缺氧心肌细胞的增加活性。

谷氨酰胺PI3K/Akt信号通路心肌细胞缺氧

大量研究表明，心血管疾病的发生过程中均伴有不同程度的缺氧。缺氧可以抑制细胞的生长，引起心肌细胞的坏死和凋亡［1］。谷氨酰胺可以明显抑制肠道缺血再灌注损伤引起的损伤，在氧化应激中有重要的保护作用。但其是否可以通过PI3k/Akt通路缓解缺氧心肌细胞的凋亡，目前尚未见研究报道［2］。本研究将培养乳鼠心肌细胞，建立缺氧细胞模型，通过体外试验进一步探讨谷氨酰胺在缺氧心肌细胞中的保护作用及可能机制。

1　资料与方法

1.1一般资料

取一定量谷氨酰胺超微粉剂溶解于无胎牛血清低糖DMEM培养基，超声促溶后，通过高速离心，取上清液，过滤除菌，低温冰箱保存，根据实验需要，使用DMEM配置不同浓度。Bax、Bcl-2兔抗鼠单克隆抗体购自美国ABcam公司，Akt鼠抗兔单抗购自Santa Cruz公司，细胞培养液、MTT试剂盒等购自Gibcol公司。

1.2分组对照组

细胞在37℃培养箱中在正常条件下培养。缺氧组：心肌细胞在95%N2+4%CO2+1%O2条件下培养，制备缺氧心肌细胞培养模型。共培养组：缺氧条件下的心肌细胞培养基中加入100 mg/L的谷氨酰胺共同培养，在培养0 h、12 h、24 h、48 h后分别收集各组细胞，检测细胞的增殖活性和凋亡情况。

1.3方法

采用Western Blot法检测各组细胞p-Akt、Bax、Bcl-2的表达，取对数生长期细胞接种于6孔板中培养，待70%～80%铺满时，消化细胞，使用细胞裂解液溶解5 min，取裂解产物蛋白进行SDS-PAGE电泳，按常规方法转膜，使用p-Akt（1∶500）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）单克隆抗体孵育1 h，二抗孵育30 min，冲洗后，暗室曝光。细胞凋亡百分率的检测：收集各组细胞，PBS冲洗3次5 min，70%乙醇固定，PBS悬浮，加入RNase 2 mL/L孵育30 min，加入PI 10 mg/L染色50 min，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡百分率。MTT法检测细胞的增殖活性：采集对数生长期细胞株，经0.25%胰酶消化，96孔板接种，每孔接种5 000个细胞/100 μL，每孔加入20 μL的MTS试剂，37℃孵育3 h，酶标仪读取每孔吸光度值（OD=490 nm），实验重复3次以减少误差，计算增殖率。

1.4统计学方法

采用SPSS 18.0统计学软件，定量资料采用均数±标准差表示，多组间定量资料比较采用单因素方差分析，方差齐性检验后，对方差齐资料使用最小显著差异法进行两两比较，方差不齐时采用Dunnett T3法进行两两比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组心肌细胞的增殖活性比较

与对照组比较，缺氧组细胞增殖活性降低，而随着时间的延长，缺氧心肌细胞与谷氨酰胺共培养组活性呈上升趋势，组间比较差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1　各组心肌细胞的增殖活性比较

2.2各组心肌细胞的凋亡率比较（见表2）

2.3各组PI3K/Akt信号通路蛋白的表达情况

Western Blot检测结果显示，与对照组比较，缺氧组p-AKT水平明显降低，bal-2表达下调，而Bax表达升高，而通过与谷氨酰胺共培养后，Akt磷酸化水平明显升高，bal-2上调而Bax表达下调，见图1、图2。

表2　各组心肌细胞的凋亡率比较

3　讨论

谷氨酰胺是近年来研究发现在大鼠肠缺血再灌注损伤中和氧化应激反应中均对机体具有保护作用的物质。其在心脑血管疾病中亦被研究证实具有明显的抗氧化和清除自由基作用，可以保护心肌细胞和血管内皮细胞的缺血缺氧损伤［3］。但其是如何提高心肌细胞对缺氧的耐受程度以及其可能的分子机制，目前尚无研究报道。Akt是PI3k的下游靶点，其磷酸化水平是评估PI3k/Akt通路的常用指标［4］。研究发现，小鼠内毒素血症模式证实抑制PI3k/Akt信号通路后加重了小鼠的心功能不全和机体的炎症反应，而激活PI3k/Akt后可以提高小鼠的生存率［5］。本研究进而设想，在体外心肌细胞缺氧模型中，心肌细胞的凋亡是否亦与PI3k/Akt信号通路的抑制有关；在缺氧条件下给予抗氧化剂谷氨酰胺共培养后，是否可以激活PI3k/Akt信号通路，增加Akt磷酸化水平，而达到减轻细胞凋亡的目的。

图1　Western Blot检测结果

图2　各组PI3K/Akt信号通路蛋白的表达情况注：与对照组比较，**P＜0.05，与缺氧组比较，*P＜0.05。

本研究结果显示，缺氧组心肌细胞AKT磷酸化水平降低。与对照组比较，MMT法证实细胞的增殖活性明显降低，但与谷氨酰胺共培养24 h后，Akt磷酸化水平明显上调，增殖活性增加而凋亡百分率降低。国外小鼠模型研究表明，在缺氧条件下，可以通过激活PI3k/Akt信号通路调节能量代谢和促进血管的形成，增强心肌细胞的抗缺氧能量［6］。大量研究证明，PI3k/Akt信号通路还参与了调控细胞形态、粘附等作用，参与了多种心血管疾病如冠脉硬化、心肌缺血、冠脉痉挛等的发生发展过程。通过激活PI3k/Akt信号通路，可以抑制冠脉痉挛，从而减轻缺血引起的心肌细胞损伤［7］。PI3k/Akt已经成为了心血管疾病治疗的一个重要靶点。通过研究影响该通路的相关因素，证实其与心肌细胞凋亡率相关［8］。本研究结果表明，在缺氧条件下，谷氨酰胺可以提高心肌细胞的增殖活性，其可能是通过PI3k/Akt信号通路对心肌细胞发挥抗缺氧损伤能力。

细胞凋亡可能是心肌细胞缺氧损伤的重要原因之一。谷氨酰胺是否通过抗凋亡实现对缺氧的心肌细胞发挥保护作用亦是本课题的研究内容之一。本研究结果显示，缺氧组心肌细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降，而凋亡蛋白Bax表达明显增加，与谷氨酰胺处理后的缺氧心肌细胞Bcl-2表达明显上调。而Bax显著下降，流式细胞仪检测细胞凋亡百分率明显降低。结果均表明谷氨酰胺可以通过调节凋亡相关蛋白而发挥保护作用。在缺血小鼠动物模型中，心肌细胞凋亡明显增加，同时存在明显的凋亡蛋白表达增加。研究证实了在缺氧条件下心肌细胞存在明显凋亡［9］。而在缺血再灌注模型中，当恢复血液供应后，小鼠肠道出现了缺血再灌注损伤，谷氨酰胺可以通过调控凋亡蛋白而发挥保护作用［10］。因此，谷氨酰胺保护缺血细胞的重要机制之一是调控细胞的凋亡。

综上所述，谷氨酰胺可以减轻缺氧心肌细胞的损伤，其作用可能是依赖于PI3k/Akt信号通路的激活。在缺氧环境下，通过上调Akt蛋白磷酸化水平，通过促进抗凋亡因子表达而抑制凋亡蛋白的表达，提高缺氧心肌细胞的增殖活性，降低凋亡百分率。但谷氨酰胺是否还通过其他环节提高心肌细胞耐缺氧能力有待进一步深入研究探讨。

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