大体积进样-非匀强电场扫集微乳毛细管电动色谱法测定化妆品中糖皮质激素

郭成方，商少明，刘俊康，沈　洁，孙雪婷，何胜俊

(江南大学　化学与材料工程学院　食品胶体与生物技术教育部重点实验室，江苏　无锡　214122)



大体积进样-非匀强电场扫集微乳毛细管电动色谱法测定化妆品中糖皮质激素

郭成方，商少明*，刘俊康，沈洁，孙雪婷，何胜俊

(江南大学化学与材料工程学院食品胶体与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122)

建立了一个简单有效的微乳毛细管电动色谱(MEEKC)在线富集-大体积进样(LVSI)与非匀强电场扫集(REFS)联用测定化妆品中4种糖皮质激素(泼尼松、氢化可的松、泼尼松龙和倍他米松)的方法。MEEKC的缓冲体系组成为:2.4%SDS,0.6%正辛烷,6.6%正丁醇,30 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.2)，分离电压为9.6 kV，进样压力为12.3 kPa，进样时间为95 s，检测波长为230 nm。在最优实验条件下，4种糖皮质激素的富集倍数为853～933倍，在0.015～14 mg/L范围内呈线性关系，检出限(S/N=3)为4～8 μg/L。应用此方法分析了化妆品样品,回收率为93.7%～103.8%，相对标准偏差(n=5)均不大于4.4%。

微乳毛细管电动色谱；在线富集；大体积进样；扫集；化妆品；糖皮质激素

糖皮质激素(Glucocorticoids)是一类由肾上腺皮质分泌的甾类激素，泼尼松(PS)、氢化可的松(HC)、泼尼松龙(PL)和倍他米松(BT)是肾上腺皮质激素类药物，具有重要的生理活性，如抗炎及抗过敏，降低毛细血管壁和细胞膜的通透性，减少炎性渗出等作用。化妆品中加入糖皮质激素可起到美白保湿的效果,但长期使用含有糖皮质激素的化妆品会产生面部毛囊萎缩、毛细血管扩张等副作用[1]，对人体面部皮肤造成严重损害。我国《化妆品规范》[2]中明确规定糖皮质激素为化妆品中禁用组分。因此，建立化妆品中糖皮质激素的经济、快速和高灵敏的检测方法对于化妆品的质量控制，确保化妆品的使用安全具有重要意义。

糖皮质激素的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3-5]、固相萃取/液相色谱法(SPE/HPLC)[6-7]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[8-9]和毛细管电泳法(CE)[10-12]等。相比之下，CE法具有快速、高效、耗样量少等特点。CE通常使用紫外检测器，为了减小谱带扩张,紫外检测主要采用柱上检测的方法,然而，由于毛细管内径较小，紫外检测的灵敏度受到很大限制。因此，对于化妆品中微量和痕量糖皮质激素检测，传统的CE法很难满足要求。目前,通过在线富集技术提高灵敏度的方法已颇受重视，该技术可通过对样品、运行缓冲液的组成以及进样程序进行简单的调控提高灵敏度，无需对商品仪器进行改造，而且富集效果好。

微乳毛细管电动色谱(MEEKC)是20世纪90年代发展起来的一种电泳新技术[13]，该技术一般采用水包油型微乳液作为分离介质，对中性物质具有良好的分离效果。但MEEKC在线富集的方法报道较少[14-16]。本研究建立了大体积进样-非匀强电场扫集微乳毛细管电动色谱法(LVSI-REFS/MEEKC)同时检测化妆品中4种糖皮质激素的方法，与常规CE相比，方法灵敏度提高了3个数量级。本方法操作简单、样品用量少、分析快速，具有良好的分离度和灵敏度。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

TH-3100型高效毛细管电泳仪(保定天惠分离科学研究所)，配紫外检测器和温控装置；未涂层毛细管(河北永年瑞沣光导纤维厂，65 cm×50 μm，有效长度50 cm)；分析天平、EF20 pH计(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；SK2200H 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；Milli-Q Refrence 超纯水机(美国Millipore公司)；旋转蒸发仪(巩义市英峪高科仪器厂)；DDS-307电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

泼尼松(PS)、氢化可的松(HC)、泼尼松龙(PL)、倍他米松(BT)标准品(上海安谱科学仪器公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)、硼砂、HBO3、NaH2PO4、NaOH、正丁醇、正辛烷、甲醇(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。化妆品样品购于本地超市。实验用水为超纯水。

1.2溶液的制备

1.2.1标准溶液的配制准确称取PS，HC，PL，BT标准品，用甲醇配制成2 mg/mL的储备液，避光4 ℃保存。使用时根据需要稀释成不同浓度的标准溶液。

1.2.2样品溶液制备准确称取化妆品样品1.0 g于50 mL离心管内，向其中加入15 mL甲醇,充分振荡5 min,超声20 min,再加入10 mL正己烷,振荡10 min,以8 000 r/min离心8 min,弃去上层正己烷层；再加入10 mL正己烷重复上述操作，下层甲醇溶液在45 ℃下减压浓缩至约1 mL。以样品基质溶液定容至10 mL，即得样品溶液。

1.3实验条件

1.3.1电泳条件缓冲体系：2.4% SDS,0.6% 正辛烷,6.6% 正丁醇，30 mmol/L硼酸盐缓冲液(pH 8.2)；检测波长为230 nm；环境温度20 ℃。

1.3.2LVSI-REFS/MEEKC条件分离电压为9.6 kV，采用压力进样，进样压力12.3 kPa，进样时间95 s。

1.3.3毛细管冲洗方法在实验前，依次用0.1 mol/L盐酸溶液、超纯水、1 mol/L氢氧化钠溶液、超纯水、运行缓冲溶液冲洗10 min。两次样品分析运行期间，分别用1 mol/L氢氧化钠溶液、超纯水、运行缓冲溶液冲洗5 min，以获得良好的分离检测重现性。

1.4LVSI-REFS/MEEKC的分离富集模式

LVSI-REFS/MEEKC的分离过程见图1。样品溶液中不含微乳粒子但电导率高于运行缓冲液(BGS)。毛细管中先充满含有微乳粒子的运行缓冲液，然后在入口端以压力进样方式引入一段样品溶液(图1A)。施加正电压后(毛细管两端插入BGS中),运行缓冲液中带负电荷的微乳粒子从阴极端向阳极端迁移,在运行缓冲液和样品界面上发生微乳堆积(图1B)。堆积的微乳粒子穿过样品区带并将分析物扫集到一个较窄的区域(图1C)。由于电渗流(EOF)的速度大于带负电微乳粒子的淌度(μ)，被扫集的样品区带在EOF的作用下向阴极移动，富集后的分析物以MEEKC模式进行分离(图1D)。

2　结果与讨论

2.1运行缓冲液与样品溶液电导率差异的影响

运行缓冲液和样品溶液的电导率差异对富集效率影响很大。分别考察了运行缓冲液(pH 8.2)和样品溶液(pH 3.6)电导率差异对富集效果的影响(见表1)。由表可知，运行缓冲液的电导率低于样品溶液的电导率时，4种激素的富集效果较好。这是由于毛细管两端施加相同的电压，运行缓冲液的电导率低，电场强度大，带电的微乳粒子在运行缓冲液中迁移速率较快，遇到低电场强度的样品区带，微乳粒子在接界处堆积进而抵挡了扫集后堆积样品区带的展宽，从而实现了较好的富集效果。

表1　运行缓冲溶液和样品溶液电导率差异的影响

2.2SDS浓度的影响

SDS浓度是影响MEEKC分离和富集的重要因素。考察了SDS浓度分别为1.2%，1.8%，2.4%，3.0%，5.4%时对分离富集效果的影响。结果显示，在较低的SDS浓度(1.2%)下，分析物的分离度和富集效果较差，随着SDS浓度的增加，分析物的保留时间延长，分离度明显改善，峰高增加，SDS浓度为2.4% 时峰高达到最大值。随着SDS浓度继续增加，电流增大，产生的焦耳热增多，导致峰高逐渐降低。且在SDS浓度为5.4%时，基线不平稳。综合考虑，选择SDS的最佳浓度为2.4%。

2.3运行缓冲液的pH值与浓度的影响

运行缓冲液的pH值对富集效果和分析时间影响很大。考察了运行缓冲液的pH值在7.4～9.0范围内对富集效果的影响(图2)。结果表明，随着pH值的增加，分析时间逐渐减少，这是由于pH值的升高引起电渗流增加所致。此外，当pH值小于8.2时,随着pH值的提高,峰高增加，峰形明显改善，当pH值大于8.2时，峰高开始降低，并伴有峰展宽。考虑到分析时间和富集效果，实验选择pH 8.2为最优值。

同时考察了pH 8.2时不同运行缓冲液的浓度(5，10，20，30，40 mmol/L)对富集效果的影响。实验结果表明，硼酸盐缓冲溶液的浓度越低，分离时间越短，但富集效果差；硼酸盐缓冲溶液浓度越高，分离时间越长,但峰高减小。当硼酸盐缓冲溶液浓度为30 mmol/L(pH 8.2)时，在25 min内可实现4种激素的基线分离，且富集效果最好。因此，确定硼酸盐缓冲溶液的最佳浓度为30 mmol/L。

2.4样品基质溶液浓度的影响

将样品分别溶解在40～80 mmol/L(pH 3.6)的磷酸盐缓冲溶液中，考察了样品基质溶液浓度对富集效果的影响。结果表明，样品基质溶液浓度为60 mmol/L时，富集效果最好，随着浓度的降低，分析时间减少，富集效果逐渐变差，这是因为样品基质溶液浓度降低，样品区带的电导率和运行缓冲液的电导率逐渐接近，整个毛细管内形成匀强电场，微乳粒子在样品区带和运行缓冲液接界处无法堆积，影响了富集效率。当浓度高于60 mmol/L时，随着浓度的增加，较高的电导率会使样品区带的电场强度随之增加，而较高的场强使样品区带压缩速度减慢并发生解聚，分析时间延长，富集效率降低。综合考虑，样品基质溶液浓度选择60 mmol/L。

2.5进样时间的选择

固定进样压力为12.3 kPa，考察了进样时间分别为70,80,90,95,100，110 s时对峰高的影响。结果表明，随着进样时间的延长，峰高明显增加。但进样时间超过95 s时，由于进样量过大导致毛细管过载，出现明显的峰展宽现象，峰高下降。因此选择最佳进样时间为95 s。

2.6富集倍数

在优化条件下，分别采用常规MEEKC和LVSI-REFS/MEEKC方法测得4种糖皮质激素标准品的峰高(图3)，分别表示为h和H，样品浓度分别为200，2 μg/mL，则富集倍数fi=(Hi/hi)×(200/2)，由此公式计算出PS，HC，PL，BT的富集倍数分别为853，893，933和925倍。

2.7线性关系与检出限

配制4种糖皮质激素系列标准溶液，在最优化条件下进行分离分析，以峰高(y)对样品浓度(x，μg/mL)进行线性回归，以3倍信噪比(S/N=3)计算得4种分析物的检出限(LOD)，结果见表2。在最优实验条件下，4种糖皮质激素在0.015～14 mg/L范围内呈良好的线性关系，其LODs(S/N=3)达4～8 μg/L。

表2　4种激素的线性范围、回归方程、相关系数及检出限

表3列举了本方法与其他方法的比较。 HPLC/UV虽然方法稳定，但需消耗大量溶剂，且灵敏度较低;LC-MS具有较高的灵敏度，但仪器价格较为昂贵，且受化妆品样品基质影响较为严重;SPE/HPLC也具有较低的检出限，但需对样品进行净化前处理和离线预富集，操作繁琐;CE-UV高效快速，但灵敏度较低。而LVSI-REFS/MEEKC采用在线富集技术，样品前处理简单，且灵敏度较高，更适合化妆品中微量或痕量激素的检测。

表3　LVSI-REFS/MEEKC检测糖皮质激素和其他方法的对比

CS：cortisone;DS：dexamethasone；ACS：acetate-cortisone;BFS：fluticasone propionate;FS：flumethasone;TD：triamcinolone acetonide;BS：budesonide;TAD：triamcinolone acetonide

2.8回收率与精密度

平行称取经测定不含激素的化妆品试样2份，其中1份测定其本底值，另1份加入8 μg/L的4种激素混合物，经乳化机高速剪切，充分混匀后，按照本方法进行分析测定，其结果如图4所示。结果表明，如果化妆品中4种激素的含量在8 μg/L以上，使用该方法均能检出。另称取上述试样5 g，平行5份，分别加入一定质量浓度的混合标准溶液，充分混匀后，按照本方法进行测定，测定结果如表4所示。结果表明，4种激素的平均回收率为93.7%～103.8%，相对标准偏差(RSD)均不大于4.4%。

2.9实际样品的测定

选择洗面奶、爽肤水、润肤霜、沐浴露、洗发水、护发素、粉底液、乳液等11种不同形态的市售及美容院专用化妆品，在优化条件下进行分析测定。结果表明，所选化妆品样品均未检出4种分析物。

3　结　论

建立了可同时测定化妆品中4种糖皮质激素的微乳毛细管电动色谱-大体积进样与非匀强电场扫集联用方法。该方法前处理简单，重现性好；通过在线大体积进样与非匀强电场扫集联用技术对化妆品中的痕量糖皮质激素进行富集，提高了分析的灵敏度，为化妆品中痕量糖皮质激素的分离测定提供了一种新方法。

[1]Zheng X Q,Zhou S Y,Zhou S W.HandbookofHygienicTestingforCosmetics.Beijing:Chemical Industry Press(郑星泉,周淑玉,周世伟.化妆品卫生检验手册.北京:化学工业出版社),2003:294-295.

[2]HygienicStandardforLosmetics.Ministry of Health,People's Republic of China(化妆品卫生规范.中华人民共和国卫生部),2007:16.

[3]Wu D N,Zheng H H,Wang P,Li J.Chin.J.HealthLab.Technol.(吴大南，郑和辉，王萍，李洁.中国卫生检验杂志)，2008,18(2):197-198.

[4]Zhao X Y,Lin Y F,Hu X Z,Fu X F,Li J,Wang P.Chin.J.Anal.Lab.(赵晓亚，林雁飞，胡小钟，付晓芳，李晶，王鹏．分析试验室)，2009,28(2):111-115.

[5]Glowka F K,Kosicka K,Karazniewicz-Lada M.J.Chromatogr.B,2010, 878(3):283-289.

[6]He D P,Long Y Q,Han M N,Shang J C.Chin.J.Spectrosc.Lab.(何东平，龙友琦，韩美娜，尚京川.光谱实验室)，2012,29(3):1469-1472.

[7]Li J,Shang S M,Chen X,Liu Y,Sun F,Song J.Chin.J.Anal.Lab.(李娟，商少明，陈新,刘瑛，孙芳，宋健.分析试验室)，2013,32(5):77-80.

[8]Herrero P,Borrull F,Pocurull E,Marcé R M.J.Chromatogr.A,2012,1224:19-26.

[9]Deceuninck Y,Bichon E,Monteau F,Dervilly-Pinel G,Antignac J P,Le Bizec B.J.Chromatogr.A,2013,1294:76-86.[10]Wu C H,Chen T H,Huang K P,Wang G R,Liu C Y.Electrophoresis，2007,28(20):3691-3696.

[11]Liu F K,Chang Y C.Chromatographia，2010,72(11/12):1129-1135.

[12]Chen X,Tian Z Z,Liu Y,Huang Y,Cao Y H.J.Instrum.Anal.(陈新，田志壮，刘瑛，黄尧，曹玉华.分析测试学报)，2011,30(2)：203-206.

[13]Huie C W.Electrophoresis,2006,27(1):60-75.

[14]Cao J,Dun W L.Talanta,2011,84(1):155-159.

[15]Abromeit H,Werz O,Scriba G K E.Chromatographia,2013,76(17):1187-1192.

[16]Sun X T,Shang S M,Chen X Y,Wang Y,Li J.Chin.J.Anal.Chem.(孙雪婷，商少明，陈秀英，王瑛，李娟.分析化学),2014,42(1):36-40.

Online Determination of Glucocorticoids in Cosmetics by Large Volume Sample Injection-Reduced Electric Field Sweeping and Microemulsion Electrokinetic Chromatography

GUO Cheng-fang,SHANG Shao-ming*,LIU Jun-kang,SHEN Jie,SUN Xue-ting,HE Sheng-jun

(School of Chemical and Material Engineering，The Ministry of Education Key Laboratory of Food Colloid and Biological Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

A simple and efficient online sample pre-concentration method composed of large volume sample injection(LVSI)-reduced electric field sweeping(REFS) and microemulsion electrokinetic chromatography(MEEKC) was developed for the determination of glucocorticoids(prednisone,hydrocortisone,prednisolone and betamethasone) in cosmetics.The microemulsion background buffer was composed of 2.4%dodecyl sodium sulfate,6.6% butanol,0.6%octane and 30 mmol/L borate buffer(pH 8.2).The separation voltage was 9.6 kV and the sample was injected at 12.3 kPa for 95 s.The detection wavelength was set at 230 nm.Under the optimum conditions，the enrichment factors ranged from 853 to 933.The calibration curves were linear in the concentration of 0.015-14 mg/L.The limits of detection(S/N=3) were in the range of 4-8 μg/L.The developed method was used to analyze corticosteroids in cosmetics with recoveries of 93.7%-103.8%and RSDs(n=5) not more than 4.4%.

microemulsion electrokinetic chromatography；online pre-concentration；large volume sample injection；sweeping；cosmetic；glucocorticoid

2015-10-19；

2016-01-13

国家质量检验检疫监督总局项目(2010IK183)

商少明，博士，副教授，研究方向：光谱分析与分离分析，Tel：0510-85917090，E-mail:smshang@jiangnan.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.009

O657.3;O625.312

A

1004-4957(2016)06-0686-06

研究简报