银杏叶提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的作用

杜 倩， 田秋霞， 付莉萍， 李剑波

(南阳市中心医院眼科，河南南阳473000)

银杏叶提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的作用

杜 倩△， 田秋霞， 付莉萍， 李剑波

(南阳市中心医院眼科，河南南阳473000)

目的:研究银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)对大鼠糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)的影响及初步机制。方法:实验共分为5组，以普通Wistar大鼠作为正常对照组(control组)、Goto-Kakizaki(GK)大鼠作为糖尿病视网膜病变模型组(DR组)，给予GK大鼠不同剂量的银杏叶提取物，分为低剂量组(GBEL组)，中剂量组(GBE-M组)和高剂量组(GBE-H组);检测各组大鼠的血糖与血-视网膜屏障损伤情况;TUNEL染色法和Western blot法分别检测视网膜组织的神经节细胞凋亡情况，核子因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、磷酸化细胞外调节蛋白激酶 (phosphorylation-extracellular regulated protein kinase，p-ERK)、细胞外调节蛋白激酶总蛋白(total extracellular regulated protein kinase，t-ERK)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)和P53的蛋白水平变化。结果:银杏叶提取物能够降低糖尿病视网膜病变大鼠的血糖，减轻血-视网膜屏障的损伤，并降低视网膜神经节细胞凋亡数，上调细胞内的Nrf2、p-ERK与Bcl-2的蛋白水平，下调P53的蛋白表达，而对t-ERK蛋白的表达水平无显著影响。结论:在糖尿病视网膜病变中，银杏叶提取物能有效地保护视网膜神经节细胞，可能与Nrf2/ERK通路的激活以及Bcl-2与P53蛋白表达有关。

银杏叶提取物;糖尿病视网膜病变;Nrf2/ERK通路;Bcl-2;P53

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见的并发症之一，作为一种进行性发展的神经退行性病变，主要表现为视网膜多细胞结构与功能的异常，如视网膜神经节细胞的凋亡。糖尿病视网膜病变的发病机制尚未明确，因此临床的预防和治疗困难。银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)提取于银杏科银杏属银杏的干燥叶，其主要有效成分银杏黄酮苷和银杏内酯被临床广泛用于预防和治疗心脑血管和神经系统的疾病。Chung等［1］研究发现银杏叶提取物中的银杏内酯可通过扩张血管增加脉络膜和视网膜的血液供应，保护视神经。另有学者发现银杏叶提取物是一种强抗氧化剂，可促进Muller细胞的谷胱甘肽产生［2］。银杏叶提取物可以减轻糖尿病视网膜病变中视网膜及玻璃体内的纤维组织增生［3］。Moreau等［4］给大鼠口服带放射性元素标记的银杏叶提取物，发现银杏叶提取物可在视网膜上达到足够的浓度并发挥其功效，提示银杏叶提取物能够对视网膜产生相关的作用。本实验通过观察银杏叶提取物对糖尿病大鼠视网膜病变的作用，并初步研究其作用机制。

材料和方法

1 实验动物

Goto-Kakizaki(GK)大鼠 40只，SPF级，体重(300±20)g，购自上海斯莱克实验有限公司;Wistar大鼠10只，SPF级，体重(300±20)g，购自南京均可生物工程有限公司。饲养于室温(22℃ ±2℃)，相对湿度(60±5)%，日照12 h，昼夜循环，自由饮水、进食。

2 实验试剂

银杏叶提取物购自中国药品生物制品检定所;伊凡斯兰购自Sigma;核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)、p-ERK和t-ERK抗体购自Santa Cruz，Bcl-2、P53抗体购自碧云天生物技术有限公司。

3 实验方法

3.1 给药处理与分组 GK大鼠随机分为4组，每组10只:模型组(DR组)，GBE-低剂量(low dose，L) 组(GBE-L组)、中剂量(medium dose，M)组(GBE-M 组)和高剂量(high dose，H)组(GBE-H组);Wistar大鼠作为正常对照组(control组)。GBE-低、中和高剂量组大鼠分别每日灌胃银杏叶提取物100 mg/kg，150 mg/kg和200 mg/kg，每天1次，共35 d。其中DR组与control组大鼠正常饮食。

3.2 血糖监测 给药完成后，监测前12 h禁食，尾尖断尾取血，血滴于试纸上，用血糖仪检测。

3.3 血-视网膜屏障损伤监测 给药完成后，将30 g/L伊凡斯兰尾静脉快速注入。2 h后，以2%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉，摘取眼球，操作轻柔(避免损伤视网膜)，分离视网膜。1份用4%多聚甲醛溶液浸泡，置于4℃保存备用。另1份晾干后称重，加入300 μL甲酰胺65℃孵育15 h，于4℃、38 000 r/min离心25 min。取上清液于628 nm处用分光光度计测量吸光度(A)值之差，参比波长740 nm，重复测量6次。

3.4 TUNEL染色法检测细胞凋亡 将各组组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水化，PBS洗涤，含2% 蛋白激酶K的双蒸水中室温孵育15 min，双蒸水洗涤2次，加入TUNEL反应液(TdT+荧光素标记dUTP)，并于37℃湿盒中避光孵育1 h，PBS冲洗2次，加入DAPI，20%甘油缓冲液封片。荧光显微镜下以552 nm激发波长、535 nm发射波长观察绿色荧光凋亡细胞。

3.5 Western blot法检测相关蛋白 取各组视网膜组织，加入裂解液，超声波细胞粉碎仪充分裂解，提取上清液进行蛋白定量，调整蛋白量。取适量裂解产物，进行SDS-PAGE分离，完成电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭1 h，加入I抗孵育过夜，TBST洗膜3次;加入相应 II抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次;进行荧光显色。

4 统计学处理

应用SPSS 16.0软件进行数据处理，各组实验结果均以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间或组内差异比较采用Bonferroni校正t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 血糖的变化

与control组相比，DR组大鼠的血糖显著升高，差异有统计学显著性(P＜0.05);与DR组相比，给予银杏提取物后，大鼠血糖随给药剂量的增大而逐渐降低，差异有统计学显著性(P＜0.05)，见表1。

2 视网膜组织中伊凡斯兰的渗透量变化

与control组相比，DR组大鼠视网膜组织中伊凡斯兰的渗透量显著升高(P＜0.05);与DR组相比，给予低剂量银杏提取物治疗的大鼠伊凡斯兰的渗透量有所下降，但差异无统计学显著性，中剂量组和高剂量组大鼠视网膜组织中伊凡斯兰的渗透量显著下降(P＜0.05)，见表1。

表1 银杏提取物对大鼠血糖和视网膜组织中伊凡斯兰渗透量的影响Table 1.The effects of Ginkgo biloba extract(GBE)on the blood glucose and osmolality of rat retina(Mean±SD.n=10)

3 大鼠视网膜神经节细胞凋亡的变化

如图1所示，DR组中可见大量TUNEL染色呈阳性的细胞，给予低剂量银杏叶提取物处理后，可观察到呈阳性的细胞少于DR组，但差异无统计学显著性;给予中、高剂量银杏叶提取物处理后，呈阳性的细胞数显著少于DR组(P＜0.05)，并随剂量升高而减少。

Figure 1.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the apoptosis of ganglion cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.图1 银杏叶提取物对大鼠视网膜神经节细胞凋亡的影响

4 各组大鼠视网膜组织中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白的表达水平变化

与control组相比，DR组的Nrf2和p-ERK蛋白水平略有增加，但差异不具有统计学显著性;与DR组相比，给予低剂量银杏叶提取物处理后，Nrf2和p-ERK的蛋白水平有所增加，但差异不具有统计学显著性，而给予中、高剂量银杏叶提取物处理后，Nrf2 和p-ERK的蛋白水平显著增加(P＜0.05)。各组t-ERK蛋白表达水平变化不明显，见图2。

5 各组大鼠视网膜组织中Bcl-2和P53蛋白的表达水平变化

与control组相比，DR组中Bcl-2的蛋白表达水平显著降低，P53蛋白表达水平显著升高(P＜0.05);与DR组相比，GBE-L组大鼠视网膜细胞中的Bcl-2和P53蛋白水平无显著变化;GBE-M组与GBE-H组中的Bcl-2蛋白表达水平显著升高，P53蛋白表达水平显著下降(P＜0.05)，见图3。

讨论

糖尿病性视网膜病变是一种具有严重致盲性的眼底病变，主要表现为视网膜毛细血管基底膜的增厚和血管的通透性增加，从而导致血-视网膜屏障被破坏，其中氧自由基参与了其病变的过程。Nrf2是一种能够调节多种抗氧化应激蛋白基因和二相解毒酶基因的重要转录调节因子，如过氧化氢酶、血红素加氧酶-1与谷胱甘肽S-转移酶等，进而可以清除体内的多种氧化性物质和毒性物质［5-6］，保护组织器官免受损伤。此外，研究发现Nrf2能够被ERK激活而发挥作用［7］。ERK是丝裂原活化蛋白激酶家族的一个重要的亚族，通过使多种转录因子磷酸化来调控细胞功能［8］。研究表明ERK的磷酸化/活化在脑缺血再灌注损伤中具有重要的神经保护作用［9］。有学者研究发现甲酯化脂氧素通过激活ERK磷酸化从而抑制细胞凋亡并促进细胞修复［9-10］。那么，银杏叶提取物是否通过Nrf2/ERK信号通路对视网膜发挥保护作用?本实验研究发现，给予不同剂量银杏叶提取物处理后，视网膜神经节细胞的凋亡减少，此外Nrf2与磷酸化的ERK蛋白水平显著上升，提示这一过程与Nrf2/ERK信号通路的激活有关。另一方面，糖尿病视网膜病变诱导大鼠视网膜抗凋亡基因bcl-2的下调与P53蛋白上调，银杏叶提取物能够逆转这一变化，其中P53能够促进多种细胞组织发生凋亡［11］。综上所述，本实验研究发现银杏叶提取物能够降低糖尿病视网膜病变大鼠的血糖，可能通过激活Nrf2/ERK信号通路，调控Bcl-2与P53蛋白的表达，从而抑制视网膜神经节细胞凋亡，对视网膜具有保护作用。Nrf2/ERK信号通路可能是银杏叶提取物的作用靶点，本实验为银杏叶提取物用于临床上治疗糖尿病视网膜病变提供了实验依据。

Figure 2.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on protein expression of Nrf2，p-ERK and t-ERK.Mean±SD.n=6.#P＜0.05 vs DR.图2 银杏叶提取物对大鼠视网膜中Nrf2、p-ERK和t-ERK蛋白表达水平的影响

Figure 3.The effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on the protein expression of Bcl-2 and P53.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs DR.图3 银杏叶提取物对大鼠视网膜中Bcl-2、P53蛋白表达水平的影响

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(责任编辑:卢 萍，余小慧)

Effect of Ginkgo biloba extract on retinopathy in diabetic rats

DU Qian，TIAN Qiu-xia，FU Li-ping，LI Jian-bo

(Department of Ophthalmology，Nanyang Central Hospital，Nanyang 473000，China.E-mail:nyduyaping@126.com)

AIM:To investigate the effect of Ginkgo biloba extract(GBE)on diabetic retinopathy(DR)and its possible mechanism in rats.METHODS:Goto-Kakizaki(GK)rats were used as a DR model，and were treated with different doses of GBE.Normal Wistar rats were used as the control.Blood glucose and retina barrier injury were analyzed，respectively.Ganglion cell apoptosis was detected by TUNEL staining.Moreover，the protein expression of nuclear factor E2-related factor 2(Nrf2)，ERK，Bcl-2 and P53，and ERK phosphorylation were examined by Western blot.RESULTS: GBE reduced blood glucose in the DR rats，attenuated retina barrier injury，and decreased the apoptosis of ganglion cells.Furthermore，the expression of Nrf2 and Bcl-2，and phosphorylation of ERK were increased after GBE treatment，whereas P53 expression was decreased.CONCLUSION:GBE protects ganglion cells against apoptosis in DR rats，which may be through activation of Nrf2/ERK pathway and regulating Bcl-2 and P53 expression.

Ginkgo biloba extract;Diabetic retinopathy;Nrf2/ERK pathway;Bcl-2;P53

R774.1;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.028

1000-4718(2016)07-1323-04

2016-02-02

2016-04-18

△Tel:0377-3200096;E-mail:nyduyaping@126.com