钙卫蛋白在肾脏缺血再灌注损伤大鼠中的表达及其作用*

陈萍祯， 朱 晔， 张慧涛， 徐晓嫦， 郑 晶， 贾 宁， 林宇静， 李玲玲， 张 桦△

(中山大学附属第五医院1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东珠海519000)

钙卫蛋白在肾脏缺血再灌注损伤大鼠中的表达及其作用*

陈萍祯1， 朱 晔1， 张慧涛1， 徐晓嫦1， 郑 晶1， 贾 宁1， 林宇静2， 李玲玲3， 张 桦1△

(中山大学附属第五医院1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东珠海519000)

目的:探讨钙卫蛋白(CALP)在肾脏缺血再灌注损伤(IRI)大鼠中的表达及其在炎症反应中的作用。方法:50只雄性SD大鼠随机分为IRI组和假手术组(sham组)，每组25只。各组分别于缺血再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h观察肾脏病理改变，检测大鼠血清尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)水平，ELISA法检测大鼠血清CALP、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-6的含量，免疫组织化学法和Western blot法分别检测大鼠肾脏CALP、Toll样受体4(TLR4)和NF-κB p65蛋白表达水平。结果:IRI组大鼠肾脏呈现不同程度的肾小管上皮细胞和间质损伤，伴炎细胞浸润。血清BUN、SCr、CALP及促炎细胞因子TNF-α、IL-6的含量在各时点均显著高于sham组(P＜0.05)。CALP、TLR4和NF-κB p65主要表达于肾小管上皮细胞胞质中，在IRI组呈高表达，在各时点各因子的表达与sham组相比均显著增强(P＜0.05)。结论:肾脏IRI大鼠的血清CALP、TNF-α和IL-6水平升高，CALP、TLR4和NF-κB p65在肾组织中表达增强。CALP在大鼠肾脏IRI的炎症反应中可能起重要作用。

肾脏;缺血再灌注损伤;钙卫蛋白;Toll样受体4

肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是引起急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的常见原因，也是心肺复苏、肾移植、多种类型休克、造影剂肾病等临床事件中不可避免的重要环节。缺血再灌注引发肾脏持续的病理生理学改变，如细胞凋亡、炎症反应、氧化应激、内皮功能障碍、肾小管堵塞和回漏等，加重缺血本身所致损伤，而其中的炎症反应是近年研究的热点［1-4］。

Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)通过与生物配体相互识别并结合，激活细胞内信号转导，促发下游通路核因子(nuclear factor，NF)-κB活化，诱导促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的产生和释放，从而引起和加重组织的炎症损伤［5-8］。近年研究表明，由S100蛋白家族成员S100A8和S100A9两种蛋白通过钙离子连接形成的异二聚体——钙卫蛋白(calprotectin，CALP)可作为内源性危险信号分子通过激活膜受体TLR4介导细胞内炎症信号转导，从而激活免疫效应细胞，参与到炎症免疫反应，故与炎症的病理生理过程密切相关［9-10］。为了探讨在肾脏IRI 中CALP是否通过TLR4/NF-κB通路参与肾脏IRI的炎症反应，本实验通过建立大鼠肾脏IRI模型，观察大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6的变化，检测肾组织CALP、TLR4和NF-κB p65的蛋白表达水平，以探讨CALP在大鼠肾脏IRI炎症反应中的可能作用。

材料和方法

1 实验动物和主要试剂

健康雄性、SPF级Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，体质量220～250 g，购于中山大学实验动物中心［合格证号为SCXK(粤)2011-0029］，饲养于动物实验室SPF级环境。

CALP ELISA试剂盒(上海源叶);大鼠TNF-α 和IL-6 ELISA试剂盒、兔抗大鼠TLR4多克隆抗体、兔抗大鼠NF-κB p65多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、小鼠多克隆抗体及组织蛋白抽提试剂(武汉博士德);小鼠抗大鼠CALP单克隆抗体(Abcam);小鼠抗人CALP单克隆抗体(Santa Cruz); PVDF膜(Millipore);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)等试剂(艺佳生物)。

2 实验方法

2.1 研究对象及分组 大鼠适应性喂养1周后，随机分为IRI组和假手术组(sham组)，每组25只。

2.2 模型建立和标本采集 大鼠术前禁食8 h，不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，常规固定、消毒、铺巾，腹正中切口，游离肾蒂，IRI组用无创小血管夹同时阻断双侧肾蒂50 min，之后松开血管夹，血流再通;sham组手术方式同IRI组，但不阻断肾蒂血流。各组分别于再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h和72 h取血(腹主动脉穿刺法)和采集肾脏标本。右肾用冰生理盐水冲洗后置液氮保存，待Western blot法测定蛋白;左肾用10%甲醛固定缓冲液固定，待制备石蜡切片。

2.3 检测指标及方法 全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血清肌酐(serum creatinine，SCr)水平;ELISA法检测大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6含量，具体步骤按各试剂盒说明书进行;肾组织石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察病理学改变;免疫组织化学法检测大鼠肾组织CALP、TLR-4和NF-κB p65的表达水平:石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸盐(检测CALP时用EDTA)抗原修复液高温高压修复，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，5%牛血清白蛋白室温封闭，滴加适当浓度I抗，4℃过夜孵育，复温，滴加II抗，二氨基联苯氨显微镜下控制显色，复染细胞核、分化、返蓝，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封片。各指标均用磷酸盐缓冲液(PBS)代替I抗作为空白对照。细胞质染色呈棕黄色为阳性结果。Western blot法检测肾组织CALP、TLR-4和NF-κB p65的表达:大鼠肾组织称重后，加入100 g/L的裂解液制备组织匀浆，匀浆转入EP管，加入PMSF(100 mmol/ L)，冰浴裂解30 min，于4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液，测定蛋白含量。取肾组织匀浆蛋白100 μg与等体积的缓冲液混合，煮沸10 min，经10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜上，2%脱脂奶粉封闭膜，室温1 h，加入小鼠抗人CALP(1∶200)单克隆抗体、兔抗大鼠TLR4(1∶200) 和NF-κB p65(1∶200)多克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的II抗，37℃孵育30 min，TBST洗膜3次，化学发光试剂处理后于暗室曝光。将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的吸光度值。以GAPDH为内参照行吸光度分析，比较目的条带/内参照条带灰度值，测定各组蛋白质的相对含量。

3 统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间的均数比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 肾脏病理学改变

Sham组的肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。IRI组大鼠随再灌注时间的延长出现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡样变，刷状缘消失，部分小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，小管腔内可见细胞管型，间质水肿及炎细胞浸润，而肾小球病变不明显。

2 肾功能改变

IRI组大鼠的BUN和SCr于再灌注6 h即显著升高，且随着再灌注时间的延长呈进行性升高，于24 h达高峰，之后逐渐下降，在各时点均显著高于sham 组(P＜0.05)，见表1。

3 血清CALP、TNF-α和IL-6含量的变化

IRI组大鼠血清CALP、TNF-α和IL-6含量于再灌注6 h即显著升高，且随着再灌注时间的延长呈进行性升高，于24 h达高峰，之后逐渐下降，在各时点均显著高于sham组(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠血清BUN、SCr、CALP、TNF-α和IL-6含量的变化Table 1.The serum levels of BUN，SCr，CALP，TNF-α and IL-6 in rats(Mean±SD.n=5)

4 肾组织CALP、TLR4和NF-κB p65蛋白的表达

4.1 免疫组化结果 CALP、TLR4和NF-κB p65主要在肾小管上皮细胞胞质中表达，sham组表达较弱，IRI组则呈高表达，于再灌注6 h即有明显表达，于再灌注24 h表达最强，之后表达减弱，见图1～3。

Figure 1.The expression of CALP in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B:reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.图1 各组大鼠肾组织CALP的表达

4.2 Western blot检测结果 CALP、TLR4和NF-κB p65在sham组大鼠肾组织有弱表达，而在IRI组则呈高表达，且随着再灌注时间延长表达逐渐增强，于再灌注24 h达到峰值，在各时点的表达水平均显著高于sham组(P＜0.05)，见图4。

Figure 2.The expression of TLR4 in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B:reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.图2 各组大鼠肾组织TLR4的表达

Figure 3.The expression of NF-κB p65 in the renal tissue of the rats(immunohistochemical staining，×200).A:sham group;B: reperfusion for 6 h in IRI group;C:reperfusion for 12 h in IRI group;D:reperfusion for 24 h in IRI group;E:reperfusion for 48 h in IRI group;F:reperfusion for 72 h in IRI group.图3 各组大鼠肾组织NF-κB p65的表达

讨论

研究表明，炎症反应是肾脏IRI的一个重要的病理生理机制，也是AKI的首要启动及贯穿因素［2-4］。本实验观察到，IRI组大鼠血清炎性因子TNF-α和IL-6含量显著增加，并随着再灌注时间的延长呈现进行性升高;同时，大鼠血清BUN和SCr水平显著升高，且与血清TNF-α和IL-6的浓度变化趋势一致。在肾脏病理上，呈现急性肾小管和间质的损伤，伴显著炎性细胞浸润，且肾脏病理改变随着再灌注时间延长逐渐加重。上述结果和本课题组前期研究一致，说明缺血再灌注诱发了炎症反应的发生，并导致肾脏的功能和病理异常。

近年研究发现［5-8，11-12］，TLR4可作为“门户”蛋白启动机体的炎症链式反应，此作用在跨膜信号转导受体家族Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)中占有重要位置。TLRs能通过识别外源性病原相关分子模式监控微生物入侵，也能通过识别内源性危险相关分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)诱导无菌性炎症反应而参与组织损伤。TLRs与配体结合后，可导致下游信号转导途径如NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶的激活，从而诱导促炎细胞因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6等的分泌与表达。TLR4是TLRs家族的重要成员，它不仅可识别革兰氏阴性细菌壁成分脂多糖，还能识别诸多内源性分子如热休克蛋白70、高迁移率族蛋白1等而活化。鉴于热休克蛋白70在器官IRI过程中可能发挥保护性作用［13］，而高迁移率族蛋白1是一种晚期炎症因子［11，14］，因此寻找IRI过程中的早期激活TLR4的内源性配体，从TLR4信号通路的源头早期控制炎症反应，对于预防肾脏IRI具有重要意义。

Figure 4.The protein expression of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissues of the rats detected by Western blot.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs sham group.图4 Western blott检测各组大鼠肾组织CALP、TLR4和NF-κB p65蛋白的表达

S100A8和S100A9是S100蛋白家族成员，是能够结合钙离子的胞质分子，在体内两者可通过钙离子连接起来形成异二聚体CALP(S100A8/S100A9)，表达在中性粒细胞、单核细胞和早期分化的巨噬细胞等细胞表面［9，15-16］。在生理状态下，CALP具有参与细胞骨架建立、调节钙离子稳态等功能，不具备促炎活性［9，15］。在炎症、肿瘤等病理状态下，由于细胞坏死或吞噬细胞激活，CALP可释放到细胞外而作为DAMP激活免疫效应细胞，参与到中性粒细胞的招募、炎性因子及黏附分子的诱导生成等病理生理过程［17-18］。

临床上CALP作为炎症标志物常用来协助诊断和监测类风湿性关节炎［19］、炎症性肠病［20］等炎症相关性疾病，而其在肾脏病中的研究尚少。近年Heller等［21］发现，肾性AKI患者尿液CALP水平是肾前性患者的60.7倍，而Seibert等［22］的报道进一步证实上述结果，肾性AKI患者尿液CALP水平较肾前性患者显著升高，尿液CALP水平可作为鉴别肾前性和肾性AKI的一个诊断标志物，其敏感性和特异性高于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白。CALP既然与AKI密切相关，那么深入研究CALP在肾脏IRI中的作用及其机制，对早期预测和防范AKI危险事件的发生有着重要意义和实用价值。CALP是否参与或通过什么信号通路介导肾脏IRI的发生与病理生理过程?CALP在IRI中的肾脏组织的表达及分布情况如何?目前鲜有文献报道。

本实验结果显示，在IRI组大鼠血清CALP含量于再灌注6 h即显著升高，且随着再灌注时间的延长呈进行性升高，并与血清TNF-α和IL-6含量升高相一致，而肾组织中CALP、TLR4及NF-κB p65表达明显增强，CALP表达与TLR4和NF-κB p65表达水平相平行，且各蛋白表达的高峰时间与血清TNF-α和IL-6水平一致，均于再灌注24 h达到高峰，之后逐渐减弱，变化趋势也与肾功能和肾脏病理改变相吻合。结果提示在肾IRI的早期，CALP对肾脏IRI的发生发展起重要作用，而且很可能作为危险相关分子模式，通过激活膜受体TLR4介导细胞内炎症信号的转导，促进NF-κB p65的表达及炎性因子的释放，加重缺血后的再灌注损伤。Vogl等［9］在实验性脓毒症休克小鼠模型中也证实，CALP可作为TLR4的内源性配体，通过识别并与TLR4结合而激活下游炎症信号通路，加剧小鼠的死亡。

虽然肾脏IRI的机制非常复杂，有多种信号通路交互影响及多种细胞因子共同作用，但本实验初步揭示，通过激活膜受体TLR4介导细胞内炎症信号转导是CALP蛋白参与炎症反应的一个重要途径。抑制CALP介导的信号转导，有望为早期防治AKI提供新靶点。

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(责任编辑:卢 萍，罗 森)

Expression of calprotectin in rats with renal ischemia-reperfusion injury

CHEN Ping-zhen1，ZHU Ye1，ZHANG Hui-tao1，XU Xiao-chang1，ZHENG Jing1，JIA Ning1，LIN Yu-jing2，LI Ling-ling3，ZHANG Hua1

(1Department of Nephrology，2Department of Pathology，3Centre of Laboratory，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:zh3196@126.com)

AIM:To investigate the expression of calprotectin(CALP)in the rats with renal ischemia-reperfusion injury(IRI).METHODS:Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation and IRI group(n= 25 in each group).Blood samples and the kidneys were obtained at 6 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after reperfusion.The pathological changes of the kidneys were observed.The serum concentrations of blood urea nitrogen(BUN)and serum creatinine(SCr)were measured.The serum levels of CALP，tumor necrosis factor-α(TNF-α)and interleukin-6(IL-6) were detected by ELISA，and the expression of CALP，Toll-like receptor 4(TLR4)and NF-κB p65 in the renal tissues were determined by the methods of immunohistochemistry and Western blot.RESULTS:Different serial ischemia changes were observed in the renal tissues，mainly in the renal tubular epithelial cells and the mesenchyma，with the infiltration of inflammatory cells.The serum levels of BUN，SCr，CALP，TNF-α and IL-6 in IRI group were markedly increased as compared with sham group(P＜0.05).The protein expression of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tubular epithelial cells in IRI group was greatly enhanced in comparison with that in sham group(P＜0.05).CONCLUSION:The serum concentrations of CALP，TNF-α and IL-6，and the protein expression levels of CALP，TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue are significantly increased in the rats with IRI，suggesting that calprotectin plays an important role in the inflammation in rats with IRI.

Kidney;Ischemia-reperfusion injury;Calprotectin;Toll-like receptor 4

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.027

1000-4718(2016)07-1317-06

2016-02-02

2016-03-16

广东省自然科学基金资助项目(No.S2013010016698);珠海市医学科研基金资助项目(No.201504)

△Tel:0756-2528189;E-mail:zh3196@126.com