GLP-1下调非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3 和SREBP-1c的表达*

侯洪涛， 裘艳梅， 张 建， 胡义亭， 苏少慧， 王玉珍

(1河北省人民医院消化科，河北石家庄050051;2河北医科大学第二医院儿科，河北石家庄050000)

GLP-1下调非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3 和SREBP-1c的表达*

侯洪涛1△， 裘艳梅2， 张 建1， 胡义亭1， 苏少慧1， 王玉珍1

(1河北省人民医院消化科，河北石家庄050051;2河北医科大学第二医院儿科，河北石家庄050000)

目的:探讨胰高血糖素样肽-l(GLP-1)对非酒精性脂肪肝大鼠SOCS-3和SREBP-1c mRNA表达的影响。方法:将雄性SD大鼠32只随机分为正常对照(NC)组、高脂(HF)组和HF+利拉鲁肽(Lira)组。HF组和HF+Lira组给予高脂饲料喂养16周，HF+Lira组高脂喂养12周后，给予Lira 600 μg·kg－1·d－1腹腔注射4周。在16周末处死大鼠。全自动生化仪检测血清ALT、AST、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC);GPO-PAP法测定肝脏TG含量;酶联免疫法测定空腹胰岛素，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);光学显微镜下观察肝脏病理变化;RT-qPCR法测定肝组织SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达水平。结果:与NC组相比，HF组血清ALT、AST、TG、TC、肝TG、FINS及HOMA-IR均明显升高(P＜0.01);HF+Lira组与HF组相比，血清的ALT、AST、TG、TC、肝TG、FINS 及HOMA-IR均下降，差异有统计学显著性(P＜0.05)。HF组肝组织SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达水平较NC组显著增强(P＜0.01);HF+Lira组较HF组SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达显著下降(P＜0.05)。结论: Lira可能通过下调肝组织SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达，改善IR，减少肝脏TG沉积，从而对非酒精性脂肪性肝病起到治疗作用。

非酒精性脂肪性肝病;胰高血糖素样肽-l;固醇调节元件结合蛋白-1c;细胞因子信号转导抑制物-3

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver di sease，NAFLD)以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征，且无过量饮酒史的临床综合征，约70%-90%的患者有单纯性脂肪肝，10%～30%的NAFLD患者存在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)，部分患者会发展为 NASH相关肝硬化［1］。近年来，NAFLD呈现以高患病率、低龄化趋势，严重危害了人们的健康。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是NAFLD的始动因素，在NAFLD的发病机制中起重要作用。研究发现，细胞因子信号转导抑制物-3(suppressor of cytokine signaling-3，SOCS-3)在NAFLD发病机制中起重要作用，其可以影响胰岛素和细胞因子信号转导，导致胰岛素抵抗［2］。SOCS-3的过表达还可引起固醇调节元件结合蛋白-1c(sterolregulatory elementbinding protein-1c，SREBP-1c)的表达增加。SREBP-1c是参与脂肪合成基因的主要转录调节因子［3］，能使肝脏脂质尤其是甘油三酯含量增加，从而导致肝脏脂肪变性。利拉鲁肽(liraglutide，Lira)是胰高血糖素样肽-l(glucagonlike peptide-1，GLP-1)类似物，动物和人体的实验均发现GLP-1能改善胰岛素抵抗及肝脂质沉积，已越来越多地被应用于NAFLD的治疗研究当中。本研究通过高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，探讨利拉鲁肽对NAFLD大鼠SOCS-3和SREBP-1c表达的影响。

材料和方法

1 材料与试剂

雄性SD大鼠32只(6周龄，体质量140～150 g)和普通饲料及猪油(河北医科大学实验动物中心);胆固醇(河北医科大学海森医药有限公司);利拉鲁肽(Novo Nordisk);胰岛素酶联免疫试剂盒(南京建成生物有限公司);TG试剂(GPO-PAP法，Roche);TRIzol试剂盒、逆转录体系和扩增体系(北京赛百盛基因技术有限公司)。引物由北京赛百胜基因技术有限公司合成。

2 动物模型及分组

大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组:正常对照(normal control，NC)组10只，给予普通饲料;高脂(high fat，HF)组22只，给予高脂饲料(普通饲料88%、猪油10%、胆固醇2%)。饲养12周后，随机处死高脂组2只，进行肝组织切片HE染色确认制备模型成功。高脂组再随机分为HF组和HF+Lira组，每组10只，HF+Lira组给予高脂喂养的同时腹腔注射药物利拉鲁肽600 μg·kg－1·d－1，每日1 次;HF组高脂饲料喂养的同时给予等体积生理盐水腹腔注射。在16周末禁食12 h，以2%戊巴比妥钠腹腔麻醉并处死所有大鼠，采血分离血清。

3 实验方法

3.1 肝组织病理学观察 每只大鼠取相同部位肝组织，置于4%多聚甲醛固定液中，常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色后光镜下观察肝脏脂肪变程度。

3.2 血和肝脏生物化学指标的测定 全自动生化仪检测血总甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)水平。酶联免疫法测定空腹血清胰岛素(fasting insulin，FINS)，由公式(FBG ×FINS/22.5)计算胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)。每只大鼠取相同部位肝组织50 mg，应用氯仿/甲醇制备肝组织匀浆并提取脂质，采用GPO-PAP法测定肝脏TG含量。

3.3 肝组织SOCS-3和SREBP-1c的mRNA测定

用TRIzol试剂盒提取肝组织总RNA，在逆转录酶的催化下合成cDNA，以cDNA为模板在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增。PCR产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像仪采集图像，PCR仪获得产物Ct值，采用2－ΔΔCt相对定量计算公式计算分析。扩增条件为95℃ 3 min;95℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 60 s，循环40次;72℃ 10 min。SOCS-3的上游引物为5’-CAAGAACCTACGCATCCA-3’，下游引物为5’-GGTGGTAAAGAAAAGGAAGG-3’(扩增产物为150 bp);SREBP-1c的上游引物为5’-CTGCTTGGCTCTTCTCTTT-3’，下游引物为 5’-CTTGTTTGCGATGTCTCC-3’(扩增产物为89 bp);β-actin的上游引物为5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物为5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’(扩增产物为150 bp)。

4 统计学处理

改革开放初期，我国兴建了大量高度资源依赖、高度资源消耗的大型国有工业企业。在过去几十年的发展中，这些企业依赖当地的资源能源优势取得了快速发展，成为了当地经济发展的支柱，在促进地区经济增长、经济结构优化、提供就业和吸纳外部资源等方面起着积极作用。

实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组之间比较用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 大鼠一般状态、肝脏形态学改变

3 组大鼠全部存活;NC组大鼠皮毛光泽，灵活好动;HF组大鼠不喜活动，皮毛光泽度差。肉眼观察，NC组大鼠肝脏色泽红润，边缘锐利整齐，HF组大鼠肝脏体积增大，边缘圆钝，色泽变黄，切面有油腻感，HF+Lira组大鼠肝脏体积较HF组减小，呈浅黄色，油腻感减轻。

2 肝组织病理学检查

光镜下观察NC组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞索呈放射状排列，胞质均匀，无脂滴浸润，汇管区及小叶内无炎细胞浸润;HF组大鼠肝细胞排列紊乱，细胞内有较多脂滴，部分肝细胞变性，有炎细胞浸润;HF+Lira组肝细胞脂肪变明显改善，肝细胞内有少量脂肪滴，炎细胞浸润改善，见图1。

Figure 1.Histopathology of liver tissue in each group(HE staining，×100).图1 各组大鼠肝组织病理学检查

3 血清AST、ALT、TC及TG的变化

与NC组相比，HF组血清AST、ALT、TC及TG升高，差异具有统计学显著性(P＜0.01);与HF组相比，HF+Lira组血清AST、ALT及TC下降(P＜0.01)，HF+Lira组血清TG水平明显降低，差异均有统计学显著性(P＜0.05);HF+Lira组血清AST、ALT及TC较NC组升高，差异有统计学显著性(P＜0.05);HF组血清TG水平较NC组明显升高，差异有统计学显著性(P＜0.01)，见表1。

表1 大鼠血清生物化学指标的变化Table 1.Serum biochemical indicators in the rats(Mean±SD.n=10)

4 肝脏的TG、FINS及HOMA-IR的变化

与NC组比较，HF组肝脏TG、FINS及HOMA-IR明显升高，差异有统计学显著性(P＜0.01);与HF组比较，HF+Lira组肝脏TG水平降低(P＜0.05)，HF+Lira组 FINS及 HOMA-IR水平降低(P＜0.01)，差异均有统计学显著性，见表2。

5 肝组织SOCS-3及SREBP-1c的mRNA表达水平

表2 大鼠肝脏甘油三酯、空腹血清胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化Table 2.Triglyceride(TG)of liver，fasting insulin(FINS)and insulin resistance index(MOMA-IR) in the rats (Mean±SD.n=10)

NC组大鼠肝组织有少量SOCS-3和SREBP-1c 的mRNA表达;HF组SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达较NC组显著增强(P＜0.01);HF+Lira组较HF组SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达显著下降(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The mRNA expression of SOCS-3(A)and SREBP-1c(B)in the liver tissues of rats detected by RT-qPCR.M:marker.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs NC group;##P＜0.05 vs HF group.图2 实时荧光定量PCR检测大鼠肝组织SOCS-3及SREBP-1c mRNA的表达情况

讨论

NAFLD是与代谢性疾病相关的肝脏疾病，常和糖尿病、肥胖、高脂血症并存，为代谢综合征在肝脏的表现。NAFLD的发生、发展与遗传、环境、代谢、肠道微生物及生活方式等多种因素相关，NAFLD的危害不仅在于其可引起肝硬化、肝衰竭及肝癌，其还可以导致心脑血管疾病的死亡率和2型糖尿病的发病率增加。NAFLD的发病机制尚未完全阐明，目前最为人们接受和认可的观点是Day和James提出的“二次打击”学说［4］。第一次打击是以胰岛素抵抗为中心所引起的肝细胞内脂肪沉积;第二次打击主要是氧化应激和脂质过氧化，是疾病进展的关键。IR是导致肝脏脂质过度沉积的原发病因，是NAFLD发病的中心环节，IR不仅参与首次打击，也参与第二次打击［5］。

SOCSs是一类具有抑制Janus激酶-信号转导及转录活化因子(Janus kinase-signal transducers and activators of transcription，JAK-STAT)信号转导的蛋白质家族，包括8个SOCS家族成员(SOCS1～SOCS7)，它们的结构类似，均由位于中央的SH2区、N区和羧基端的SOCS盒组成。JAK-STAT信号转导的瀑布级联效应是许多细胞因子的胞内信号转导通路。SOCS-3 是SOCS家族的主要成员之一，在体内广泛分布于肝脏、白色脂肪、胰腺、心脏、脑、小肠、大肠等组织器官。IL-6、IL-2、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、生长激素等许多细胞因子，都能诱导SOCS-3的表达，上调的SOCS-3通过多个环节、多种途径影响胰岛素信号转导，导致胰岛素抵抗［6］，在NAFLD的IR机制中发挥重要作用。SOCS-3还参与了其它细胞因子诱导的胰岛素抵抗。Senn等［7］通过体外培养人肝癌细胞进行研究，发现SOCS-3参与了IL-6介导的肝细胞胰岛素抵抗。SOCS-3亦可引起瘦素抵抗［8］，瘦素抵抗在NAFLD形成过程中亦起着重要作用。本实验应用 liraglutide干预NAFLD大鼠4周后，发现SOCS-3表达水平降低，并且减轻了胰岛素抵抗。

研究发现［9］NAFLD时肝脏SOCS-3表达上调不仅引起胰岛素抵抗，还能通过上调肝脏SREBP-1c的表达使脂肪酸合成增加以及肝脏脂肪沉积。SREBP-1c是一类位于内质网上的膜连接蛋白，是SREBPs中的一员，主要在肝脏和脂肪细胞中表达，它能调控脂肪细胞的分化和脂肪在细胞内的异位积聚，是动物体内脂质合成的一个重要的调节因子，在NAFLD形成中具有重要的作用。SREBP-1c的调控主要发生在转录水平，它直接参与调控有关脂肪酸、甘油三酯合成和葡萄糖代谢相关酶基因的表达，包括乙酰辅酶A合酶、乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)、脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)等，能激活脂肪酸合成途径中多种基因转录子，启动合成程序，从而使肝脏脂质尤其是甘油三酯含量增加，从而导致肝脏脂肪变性。SOCS-3是JAK-STAT通路的负向调节因子，STAT能够抑制SREBP-1c的启动子活性，SOCS-3又可以下调STAT，当其介导的阻抑作用减弱时SREBP-1c表达增强。本研究结果显示，高脂饮食喂养大鼠12周后SREBP-1c的mRNA表达水平增加，肝脏TG含量增多，liraglutid能够降低SREBP-1c的mRNA表达，降低肝脏TG含量，并且肝组织SOCS-3的mRNA表达水平与SREBP-1c 的mRNA呈正相关。

GLP-1是由肠道L细胞分泌的一种生理性多肽，是肠促胰岛素的一种，因其具有促进胰岛素释放、延缓胃排空、降低胰升血糖素及降低食欲等生理作用，目前被广泛应用于2型糖尿病的治疗。Liraglutide是新近合成的一种GLP-1受体激动剂，与人GLP-1具有97%同源性。GLP-1和细胞上的GLP-1受体结合实现其生物学作用，研究表明，肝细胞上亦有GLP-1受体的表达［10］。Trevaskis等［11］通过建立NASH动物模型发现，GLP-1受体激动剂能够改善肝脏脂质沉积，并且能改善NASH小鼠的代谢、生化及组织病理学参数。本实验结果也显示，经给药治疗4周后，HF+Lira组大鼠血清ALT、AST、TG及TC水平明显降低，肝脏TG含量和空腹胰岛素水平降低，肝脏脂肪变及炎症减轻。本实验也提示，liraglutide可能通过下调肝组织SOCS-3和SREBP-1c的mRNA表达，改善IR及肝脏脂质代谢，而对NAFLD起治疗作用。

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(责任编辑:陈妙玲，罗 森)

GLP-1 down-regulates mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in rats with nonalcoholic fatty liver disease

HOU Hong-tao1，QIU Yan-mei2，ZHANG Jian1，HU Yi-ting1，SU Shao-hui1，WANG Yuzhen1

(1Department of Gastroenterology，People’s Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050051，China;2Department of Pediatrics，The Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China.E-mail:llvzi@126.com)

AIM:To investigate the effects of glucagon-like peptide-1(GLP-1)on mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in the rats with nonalcoholic fatty liver disease.METHODS:Male SD rats were randomly divided into normal control(NC)group，high fat(HF)group and HF+liraglutide(Lira)group.The rats in HF group and HF+ Lira group were given high-fat diet for 16 weeks.After 12 weeks of high-fat diet feeding in HF+Lira group，Lira(600 μg ·kg－1·d－1)was intraperitoneally injected for 4 weeks.At the end of the 16th week，the rats were killed.The pathological changes of the liver were observed under optical microscope.The serum levels of alanine aminotransferase(ALT)，aspartate aminotransferase(AST)，triglyceride(TG)and total cholesterol(TC)were detected by automatic biochemical analyzer.TG contents of liver were measured by GPO-PAP method.The fasting insulin(FINS)was determined by ELISA，and insulin resistance index was assessed by homeostasis mode assessment(HOMA-IR).The mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in the liver tissues was detected by RT-qPCR.RESULTS:Compared with NC group，HOMA-IR，TG of liver，and the serum levels of ALT，AST，TG，TC and FINS in HF group were obviously increased(P＜0.01).Compared with HF group，HOMA-IR，TG of liver，and the serum levels of ALT，AST，TG，TC and FINS in HF+Lira group were all obviously decreased(P＜0.05 or P＜0.01).The mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c in HF group was significantly higher than that in NC group(P＜0.01).The mRNA expression of SOCSV3 and SREBP-1c in HF+Lira group was significantly decreased as compared with HF group(P＜0.05).CONCLUSION:Liraglutide may improve the IR and re-duce TG of liver through decreasing the mRNA expression of SOCS-3 and SREBP-1c，so as to play a therapeutic role in nonalcoholic fatty liver disease.

Nonalcoholic fatty liver disease;Glucagon-like peptide-1;Sterol regulatory element binding protein-1c;Suppressor of cytokine signaling-3

R575.5;R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.026

1000-4718(2016)07-1312-05

2015-12-21

2016-03-09

河北省卫生计生委基金资助项目(No.ZL20150117)

△Tel:0311-85989910;E-mail:llvzi@126.com