肾活检冰冻切片不同储存条件对免疫荧光结果的影响*

赵 黎， 朱萌华， 金 娟， 龚建光， 李一文， 何 强

(浙江省人民医院肾脏病科，浙江杭州310014)

·实验技术·

肾活检冰冻切片不同储存条件对免疫荧光结果的影响*

赵 黎， 朱萌华， 金 娟， 龚建光， 李一文， 何 强△

(浙江省人民医院肾脏病科，浙江杭州310014)

目的:探讨肾活检组织冰冻切片储存温度对免疫荧光结果的影响。方法:选择2015年1月～2015年6月浙江省人民医院肾脏病科肾脏活检标本100例，将同一肾穿组织同时切两套切片分别储存于－70℃低温冰箱和－12℃冷冻切片机内，其中储存于－70℃低温冰箱的切片作为实验组，储存于－12℃冷冻切片机内的切片作为对照组，次日用直接免疫荧光法检测免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、补体(C3、C4和C1q)及纤维蛋白原，间接免疫荧光法检测Ⅳ型胶原a3和a5链，荧光显微镜下观察定性及半定量结果。结果:实验组3+～4+IgG 16例，对应的对照组IgG均为1+～2+，阳性强度明显弱于实验组，差异有统计学显著性(P＜0.05);实验组3+～4+ a3 99例，对照组1+～2+a3 92例，阴性8例;实验组3+～4+a5 99例，对照组1+～2+a5 92例，阴性8例，对照组阳性强度减弱，差异有统计学显著性(P＜0.05)。实验组4+IgA 15例，3+IgA 19例，3+IgM 15例，2+IgM 11例，4+C3 13例，3+C3 12例，相对应的对照组阳性强度没有明显减弱，差异无统计学显著性。结论:肾活检冰冻切片免疫荧光结果受切片储存温度影响大，其中对IgG和Ⅳ型胶原免疫荧光阳性强度影响更大，建议肾脏活检组织冰冻切片置于－70℃低温冰箱储存。

储存温度;肾脏活检;免疫荧光;冰冻切片

免疫荧光技术对肾脏疾病的诊断及其分类具有极其重要的作用，在肾活检病理诊断中的地位是其它组织化学、电子显微镜检查等无法替代的。应用冰冻切片进行免疫荧光检查，被认为是肾活检免疫病理检查的重要方法［1-2］。本研究收集我科2015年1月～2015年6月肾脏活检标本100例，行直接免疫荧光法检测免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、补体(C3、C4和C1q)和纤维蛋白原，间接免疫荧光法检测Ⅳ型胶原a3和a5链，现报告如下。

材料和方法

1 一般材料

浙江省人民医院肾脏病科肾脏活检组织100例，同一组织恒温冰冻切片同时切两套片，4 μm厚，分别储存于－70℃低温冰箱和－12℃冷冻切片机内备用。

2 试剂

直接法兔抗人荧光抗体IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纤维蛋白原，间接法I抗单克隆鼠抗人Ⅳ 型胶原a3抗体和a5抗体(Eurodiagnostica);II抗FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(北京中杉公司)。0.01 mol/L(pH 7.2～7.4)PBS缓冲液(北京中杉公司);甘油(浙江惠康药业公司)。

3 仪器

CM3050冷冻切片机、DM2500荧光显微镜及数码摄像系统(Leica)。

4 免疫荧光步骤

4.1 直接法检测IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纤维蛋白原 实验组冰冻切片－70℃低温冰箱储存，对照组冰冻切片－12℃冷冻切片机储存次日取出，在室温下风干;PBS冲洗3 min 2次;滴加兔抗人的荧光抗体 IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q和纤维蛋白原(1∶40稀释);37℃水浴箱孵育60 min;PBS冲洗3 min 2次;甘油封片;荧光显微镜下观察。

4.2 间接法检测Ⅳ型胶原 切片分组处理后滴加单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原a3抗体(1∶30)，检测a5链时先滴加尿素处理10 min，PBS冲洗后再滴加a5抗体(1∶40);37℃水浴箱孵育120 min;PBS冲洗3 min 2 次;滴加 II抗 FITC标记的山羊抗小鼠 IgG抗体(1∶50);37℃水浴箱孵育30 min;PBS冲洗3 min 2 次;甘油封片;荧光显微镜下观察。

5 结果判定

荧光显微镜下观察肾组织荧光强度。观察每张切片的有效肾小球数，以及IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、纤维蛋白原、a3和a5荧光抗体的沉积部位，即肾小球的毛细血管壁、系膜区、肾小囊基底膜、间质血管壁及间质细胞等;观察荧光抗体沉积的特点并根据视野内荧光的强度进行半定量评分:低倍镜下未见荧光、高倍镜下似可见荧光为阴性(－);低倍镜下似可见荧光，高倍镜下可见荧光为弱阳性(+);低倍镜下明显可见荧光，高倍镜下清晰可见荧光为阳性(++);低倍镜下清晰可见荧光，高倍镜下荧光耀眼为较强阳性(+++);低倍镜下荧光耀眼，高倍镜下荧光刺眼为强阳性(++++)［3］。

6 统计学处理

等级资料采用非参数秩和检验，采用SPSS 17.0软件进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

肾脏活检标本共100例，其中实验组3+～4+ IgG 16例，对应的对照组IgG均为1+～2+，阳性强度明显弱于实验组，差异有统计学显著性(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.Expression of IgG (directimmunofluorescence，×400).A:－70℃ condition;B:－12℃ condition.图1 IgG实验组和对照组结果

实验组3+～4+a3 99例，对照组1+～2+a3 92例，阴性8例，见图2。

Figure 2.Expression of type IV collagen a3 chain(indirect immunofluorescence，×400).A: －70℃ condition; B:－12℃ condition.图2 a3实验组和对照组结果

实验组3+～4+a5 99例，对照组1+～2+a5 92例，阴性8例，对照组阳性强度减弱，差异具有统计学显著性(P＜0.05)，见图3。

实验组4+IgA 15例，3+IgA 19例，3+IgA 15例，2+IgA 11例，4+C3 13例，3+C3 12例，对照组阳性强度无明显变化，见表1。

C4、C1q和纤维蛋白原两组间差异无统计学显著性。

Figure 3.Expression of type IV collagen a5 chain(indirect immunofluorescence，×400).A: －70℃ condition; B:－12℃ condition.图3 a5实验组和对照组结果

讨论

肾穿刺活检组织冰冻切片免疫荧光染色特异性强、敏感性高，染色步骤简单，节省时间，定位准确，强度易于判读，是一种最简便、快速的方法［1］，在临床上得到广泛的应用。但是，荧光染色结果受到多种因素的影响，如组织离体时间、切片保存温度、切片保存时间、荧光抗体效价等［4-8］，其中抗原的保存是否完整直接影响免疫荧光结果，而保存温度成为关键，尤其是肾活检标本体积较小，受保存温度影响更大。

表1 肾活检冰冻切片不同储存条件对免疫荧光结果影响的比较Table 1.Comparison of the effects of different storage conditions on the immune fluorescence results in frozen sections of renal biopsy

本实验100例肾活检标本中，储存于－12℃冷冻切片机内的对照组冰冻切片次日染色的荧光结果显示16例IgG阳性程度均减弱，99例Ⅳ型胶原a3链和a5链阳性程度也均减弱，证实不同储存温度对免疫荧光结果影响明显，可能的原因为储存于－12℃冷冻切片机内的对照组冰冻切片由于受到冷冻切片机每天自动除霜程序的进行导致切片机内的温度上升，达不到－12℃的储存条件，因此导致冰冻切片抗原的丢失，以往我们的经验发现在冷冻切片机内保存的切片出现自溶现象，也提示了该可能原因，因此，不建议将冰冻切片保存在冷冻切片机里过夜或更久时间，而应该将切片保存于低温冰箱内。既往研究表明，冰冻切片要求肾穿刺后数小时内即完成免疫荧光染色检测，若时间过长，高温可能导致肾组织自溶影响结果判断［9］。因此，所取标本应于当日或次日切片，若当日不切片，应置于－70℃的冰箱或液氮罐内保存［10］，当日切好的片子也应及时置于－70℃的冰箱保存。本次研究进一步表明储存于－12℃冷冻切片机内的冰冻切片导致抗原丢失，影响免疫荧光结果，建议置于－70℃低温冰箱储存，以保持抗原活性，防止抗原移位或丢失。

［1］ 王海燕.肾脏病学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社，2008:548-596.

［2］ 邹万忠.肾活检病理学［M］.第2版.北京:北京大学医学出版社，2009:282-285.

［3］ 李 兵，苗里宁，刘树军，等.肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色方法的探讨［J］.中国实验诊断学，2009，13(12):1728-1730.

［4］ 陈志胜，计慧琴，王丙云.冰冻和石蜡切片对TUNEL染色结果的影响［J］.中国病理生理杂志，2005，21(9): 1801，1810.

［5］ 倪灿荣，马大烈，戴益民.免疫组织化学实验技术及应用［M］.北京:化学工业出版社，2006:37-63.

［6］ 余英豪.肾穿刺活检病理检查的规范化［J］.诊断病理学杂志，2006，13(6):405-406.

［7］ 胡海霞，熊正文，刘俊堂.微波快速免疫荧光在肾活检中的应用［J］.实用医学杂志，2006，22(20):2433-2434.

［8］ 朱小兰，张 威，骆新兰.不同固定剂对肾穿刺冷冻切片免疫荧光染色的影响［J］.诊断病理学杂志，2013，20(7):441-443.

［9］ 朱国良，许成英，石麒麟，等.双重修复石蜡切片免疫荧光染色在肾活检组织中的应用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2011，12(3):246-247.

［10］吴潮清，龚智峰，彭小梅，等.免疫荧光检测在肾活检组织中的应用体会［J］.广西医学，2005，27(3):399-400.

(责任编辑:林白霜，罗 森)

Effect of different storage temperatures on immunofluorescence results in frozen sections of kidney biopsies

ZHAO Li，ZHU Meng-hua，JIN Juan，GONG Jian-guang，LI Yi-wen，HE Qiang

(Department of Nephrology，Zhejiang Provincial People’s Hospital，Hangzhou 310014，China.E-mail:strong_he@163.com)

AIM:To investigate the effect of storage temperature in renal biopsy tissue frozen section on immunofluorescence results.METHODS:One hundred renal biopsy samples of Zhejiang Province People’s Hospital from January to June，2015 were enrolled.Two sets of cutting slices were stored in－70℃ low temperature refrigerator as experimental group and in－12℃ freezing cryostat as control group.The immunoglobulins(IgG，IgA and IgM)and complements(C3，C4 and C1q)as well as fibrinogen were detected with direct immunofluorescence in the next day.The typeⅣcollagen a3 and a5 chains were also detected by indirect immunofluorescence，and the qualitative and semi-quantitative results were observed under the fluorescence microscope.RESULTS:There were 16 cases of 3+～4+IgG in the experimental group，while the corresponding IgG was all 1+～2+in control group，significantly weaker than that in experimental group.There were 99 cases of 3+～4+a3 and 3+～4+a5 in experimental group，white there were 92 cases of 1+ ～2+a3/a5 and 8 cases negative in control group.The positive intensity was decreased in control group with statistical difference between the 2 groups(P＜0.05).There were 15 cases of 4+IgA，19 cases of 3+IgA，15 cases of 3+IgM，11 cases of 2+IgM，13 cases of 4+C3，and 12 cases of 3+C3 in experimental group.The control group were similar to the results of experimental group，and no difference between the 2 groups was observed.CONCLUSION:The immunofluorescence results of renal biopsy frozen sections are highly affected by the section storage temperature，which has greater influence on the immunofluorescence positive intensity of IgG and typeⅣcollagen.The renal biopsy frozen section should be stored in－70℃ low temperature refrigerator.

Storage temperature;Renal biopsy;Immunofluorescence;Frozen section

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2016.07.032

1000-4718(2016)07-1342-03

2016-01-08

2016-04-02

省科技厅重大专项(No.2014C03047-2);省部共建项目(No.WKJ2013-2-002)

△Tel:0571-85893689;E-mail:strong_he@163.com