miR-449a靶向调节c-Met抑制Hela细胞的迁移和侵袭

夏雪梅，郑红枫，陈迪文，程晓燕，严红艳（丽水市人民医院，浙江 丽水323000）

miR-449a靶向调节c-Met抑制Hela细胞的迁移和侵袭

夏雪梅，郑红枫，陈迪文，程晓燕，严红艳
（丽水市人民医院，浙江 丽水323000）

目的探讨microRNA-449a（miR-449a）在宫颈癌中的表达及其对宫颈癌进展的作用机制。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）测定miR-449a及其靶向调节分子c-Met在宫颈癌组织及正常宫颈标本（对照组）中的表达水平。构建转染miR-449a高表组（miR-449a组）、转染c-Met干扰质粒组（siRNA组）和相应的空载质粒组 （mock组），qPCR检测miR-449a和c-Met mRNA表达量；免疫印迹法检测c-Met、MMP2和MMP9蛋白水平变化；细胞划痕修复和Transwell侵袭试验进一步观测miR-449a和c-Met对细胞迁移和侵袭能力的影响。结果miR-449a在宫颈癌组织中表达量低于对照组（P＜0.05），c-Met mRNA在宫颈癌组织中的表达高于对照组（P＜0.05），两者间呈负相关关系（r=-0.32，P＜0.05）。在宫颈癌细胞Hela细胞中过表达miR-449a后，c-Met mRNA的表达水平降低（P＜0.05），并且蛋白水平也明显降低。miR-449a能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05），抑制c-Met表达后也能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力 （P＜0.05）。结论miR-449a通过靶向抑制c-Met的表达抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。miR-449a可能是潜在的宫颈癌筛查和诊断分子标志物，并为宫颈癌个体化治疗提供一个新的方向。

宫颈癌；miR-449a；c-Met

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，居全球女性癌症患者死亡原因的第4位，且出现年轻化趋势，部分早期宫颈癌已有远处淋巴结转移［1-2］。虽然以往研究表明HPV感染与宫颈癌密切相关，但是感染HPV患者并不都发展成为浸润癌，宫颈癌浸润转移可能存在其他机制。c-Met是一种编码肝细胞生长因子受体（HGFR）的原癌基因，其编码产物刺激细胞增殖、入侵、组织血管生成及防止细胞凋亡［3］。c-Met在多种恶性肿瘤（包括宫颈癌）中高表达并促进肿瘤的侵袭和转移［4-6］。Luo等［7］已经证实miR-449a通过靶向调节c-Met的表达水平抑制了肺癌细胞迁移和侵袭。miRNAs是一类短链非编码RNA分子，与3'UTR特异性结合调节靶基因的表达水平，从而参与细胞和生物的各项生命进程［8］。因此，本文假设miR-449a通过靶向调节c-Met参与宫颈癌的浸润和转移进程，研究两者对宫颈癌浸润和转移的影响机制，可为宫颈癌的筛查、诊断和预后提供新的思路。

1　资料与方法

1.1一般资料选取丽水市人民医院2013年12月～2014年12月经术前活检、术后病理诊断为宫颈癌的宫颈标本34例，年龄38～75岁，中位年龄52岁。所有患者取标本前均未接受化疗或放疗，既往无其他恶性肿瘤史。另选取同期正常宫颈标本22例，为子宫肌瘤行子宫全切的正常宫颈组织，年龄28～69岁，中位年龄53.5岁。手术切除的宫颈标本离体后，立即于无菌状态下沿肿瘤边缘取较为新鲜无坏死的肿瘤组织切成长径3mm的小碎块，装入无菌、无RNA酶的EP管并立即放入液氮罐中，转存入-80℃冰箱内保存。活检标本离体后直接放入-80℃冰箱保存。所有研究标本的收集均获得患者知情同意。

1.2主要试剂宫颈癌细胞系Hela购自中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清（美国 NTC公司）的DMEM培养基 （美国Gibico公司）在37℃，5%CO2培养箱培养；miR-449a过表达质粒、c-Met干扰质粒和空载质粒购自上海吉玛生物技术有限公司；转染试剂Lipofectamine2000TMReagent（美国invitrogen公司）；杀稻瘟菌素 （美国invitrogen公司）；兔单克隆抗体c-Met（Y）（1：2000，美国Abcam公司）；兔单克隆抗体MMP2（1：5000，美国Abcam公司）；兔单克隆抗体MMP9（1：5000，美国Abcam公司）；兔单克隆抗体GAPDH（1：3000，美国Abcam公司）；辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔二抗（1：3000，碧云天公司）；ECL显色液（碧云天公司）。

1.3方法

1.3.1细胞转染取稳定生长的对数生长期Hela细胞消化后铺板，3×105个/孔于6孔板中，分别转染miR-449a过表达质粒（miR-449a组）、c-Met干扰质粒 （siRNA组）和空载质粒（mock组）。转染前更换为无双抗培养基，按照质粒DNA用量为1μg/mL、质粒DNA Lipofectamine2000=1：2的比例转染细胞，6小时后更换新鲜培养基，12～24小时后利用荧光显微镜观察细胞的转染效率。以杀稻瘟菌素 15μg/mL筛选细胞，挑取单克隆扩大培养。

1.3.2miR-449a和c-Met mRNA检测采用荧光定量PCR（qPCR）检测。用miReasy mini kit试剂盒（德国Qiagen公司）提取组织和细胞中总RNA（包含miRNA），按试剂盒说明书操作。取200ng RNA进行逆转录和荧光定量PCR。采用miR-449a特异性逆转录引物和PCR引物 （美国thermo fisher公司）进行逆转录和PCR（试剂购自日本TAKARA公司）检测miR-449a表达量，以U6作为内参。采用非特异性引物进行逆转录、c-Met特异性引物 （美国invitrogen公司）进行qPCR检测c-Met mRNA表达量，以GAPDH作为内参。反应条件参照各自的试剂盒说明书。c-Met引物序列：上游 5′-TCTTGGGACATCAGAGGGTC-3′；下游5′-TGACTGCAGGACTGGAAATG-3′；GAPDH引物序列：上游5′-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3′；下游5′-ATGATCTTGA-GGCTGTTGTCATA-3′。

1.3.3c-Met、MMP2、MMP9蛋白检测采用免疫印迹法检测。收集细胞，PBS洗2遍，离心，弃上清，每管加入100μL细胞裂解液，吹打混匀，置于冰上裂解5分钟，4℃ 12500g离心15分钟，取上清。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒 （碧云天生物）测定总蛋白浓度。5×loading buffer以4：1体积比与细胞裂解产物混匀，100℃变性3分钟，取20μg总蛋白进行免疫印迹实验。利用ECL显色液和凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）曝光显影。

1.3.4划痕实验取稳定生长的细胞铺于12孔板中，细胞融合度为80%左右时用200μL移液枪头垂直在12孔板底部划线，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，去掉悬浮细胞，加入2%胎牛血清培养基，显微镜拍照，观察0、24、48小时的细胞迁移情况。用ImagePro Plus软件对图片进行定量，计算划痕闭合率。

1.3.5侵袭实验采用无血清培养基以10：1体积比稀释基质胶 （美国BD公司），取50μL平铺于Transwell小室（美国Corning公司），37℃放置24小时。取稳定生长的细胞，消化成单细胞悬液，PBS洗2遍，用0.5%胎牛血清培养基重悬细胞，用计数板计数后，取5万个细胞溶于200μL 0.5%胎牛血清培养基中，铺于含有基质胶的小室上室，下室加入10%胎牛血清培养基，置于37℃，5%CO2培养箱中24小时。4%多聚甲醛固定20分钟，结晶紫染色20分钟，用棉签拭去上室细胞后显微镜下拍照，每个小室随机选取9个高倍镜视野进行细胞计数，取平均数记为结果。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计学软件进行分析，计量资料采用独立样本t检验或单因素方差分析进行组间差异分析；计数资料采用χ2检验或Fisher's精确概率法；相关性分析采用Spearman法；所有实验均重复3次后进行统计。

2　结果

2.1miR-449a和c-Met mRNA在宫颈癌中的表达miR-449a在宫颈癌组织中的表达低于对照组，c-Met mRNA的表达高于对照组 （均P＜0.05），详见表1。两者之间呈显著负相关 （r=-0.32，P＜0.05），详见图1。

表1　两组miR-449a及其靶分子c-Met mRNA表达水平的比较（±s）

表1　两组miR-449a及其靶分子c-Met mRNA表达水平的比较（±s）

与对照组比较*P＜0.05

组别　n　miR-449a相对表达量 c-MetmRNA相对表达量对照组　22　1.08±0.23　1.40±0.53宫颈癌组　34　0.33±0.15*　38.14±10.42*

图1　宫颈癌组织中miR-449a和c-Met mRNA表达量的相关性

2.2质粒转染细胞株中蛋白表达水平成功构建miR-449a高表达组，miR-449a组中miR-449a的表达量高于mock组 （P＜0.05）；miR-449a组c-Met的表达量低于mock组 （P＜0.05）；为进一步阐释miR-449a作用机制，构建c-Met低表达组（siRNA组），siRNA组中c-Met表达量较mock组降低 （P＜0.05），详见表2。免疫印迹结果进一步确认在miR-449a组和siRNA组中c-Met蛋白表达量都显著低于mock组，同时与细胞迁移和侵袭能力密切相关的MMP2、MMP9蛋白水平也明显降低（图2）。

表2　鉴定质粒转染细胞株中miR-449a及其靶分子c-Met mRNA的表达水平

图2　质粒转染细胞株中蛋白表达水平

2.3miR-449a对Hela细胞迁移和侵袭能力的影响miR-449a组细胞在24小时和48小时迁移率均较mock组降低（P＜0.05，图3A～3B），细胞侵袭能力较mock组降低（P＜0.05，图3C～3D）；siRNA组细胞在24小时和48小时迁移率均较mock组降低（P＜0.05，图4A～4B），细胞侵袭能力较mock组降低（P＜0.05，图4C～4D）。

3　讨论

miRNA根据碱基互补配对原则靶向结合mRNA，通过降解mRNA或阻碍其翻译从而调节靶基因的表达。miR-449a在多种肿瘤中表达下调，并可通过靶向调节GMNN、MET、CCNE2、SIRT1和CDK6等基因的表达，影响肿瘤的发生、发展过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭［9］。c-Met在上皮起源的细胞中正常表达，而在结直肠癌、甲状腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、黑色素瘤和胃癌等癌组织中过度表达［10］。在宫颈上皮内瘤变组织中的表达情况，提示c-Met的过度表达促使宫颈组织发生上皮内瘤变，且在其向上皮恶性变的过程中扮演着重要的角色［6］。

本研究首次报道了miR-449a在宫颈癌中的表达情况，发现miR-449a在宫颈癌组织中的表达低于对照组。为进一步研究miR-449a在宫颈癌进展过程中的作用机制，本研究观察了过表达miR-449a后c-Met蛋白表达的变化，发现c-Met蛋白表达显著下调。过表达miR-449a和抑制c-Met的表达均能显著抑制宫颈癌细胞系Hela细胞的迁移

图3　miR-449a对Hela细胞迁移和侵袭能力的影响（3A～3B：细胞划痕实验及其统计结果；3C～3D：细胞侵袭实验及其统计结果）

图4　c-Met对Hela细胞迁移和侵袭能力的影响（4A～4B：细胞划痕实验及其统计结果；4C～4D：细胞侵袭实验及其统计结果）

和侵袭能力。近年来，临床前期基础研究表明宫颈癌基因治疗是很有潜力的治疗手段，对与宫颈癌生长分化相关的基因进行研究，可为宫颈癌的筛查、诊断和预后提供新的策略。miR-449a可能是潜在的宫颈癌的筛查和诊断分子标志物，并为宫颈癌个体化治疗提供一个新的方向。此外，c-Met可能是潜在的宫颈癌治疗靶标。

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