大黄酸对2型糖尿病大鼠胰腺的保护作用

段淑芳，胡江（浙江省新华医院，浙江 杭州310005）

大黄酸对2型糖尿病大鼠胰腺的保护作用

段淑芳，胡江
（浙江省新华医院，浙江 杭州310005）

目的观察大黄酸对2型糖尿病大鼠的炎症反应及胰岛素的抵抗作用，探讨大黄酸改善胰岛素抵抗的可能机制。方法由链脲佐菌素法（STZ）建立2型糖尿病大鼠模型，将造模成功的糖尿病大鼠随机分为糖尿病模型组及大黄酸低剂量组25mg/（kg·d）、中剂量组50mg/（kg·d）、高剂量组100mg/（kg·d），连续给药8周后，观察不同剂量大黄酸对2型糖尿病大鼠血糖、胰岛素抵抗指数、炎症介质TNF-α、IL-1β及胰腺组织病理的影响。结果大黄酸低、中、高剂量组均可以改善胰岛素抵抗，保护胰岛细胞。大黄酸中、高剂量组能够同时明显减少2型糖尿病大鼠TNF-α和IL-1β炎症介质的释放量。结论大黄酸对糖尿病大鼠胰腺细胞具有保护功能，可能与通过抑制炎症介质释放、改善胰岛素抵抗、恢复胰岛细胞功能有关。

大黄酸；糖尿病大鼠；胰岛素抵抗；炎症反应

2型糖尿病的重要发病机制是胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗与炎症反应密切相关，因此抑制炎症反应，改善胰岛素抵抗，延缓糖尿病并发症发生发展是目前糖尿病治疗的关键［1］。前期研究已证实，大黄酸可以改善糖尿病大鼠的肝肾功能，但是机制不明［2］，本研究通过观察大黄酸对糖尿病大鼠的炎症反应、胰岛素抵抗、胰腺病理的作用，阐述大黄酸改善胰岛素抵抗的可行性机制，为糖尿病防治和大黄酸的进一步开发奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1动物SPF级SD大鼠58只，雄性，体质量（200±240）g，由中国科学院上海实验动物中心提供［实验动物使用许可证号：SCXK（沪）2003-0003］。SPF级屏障系统大鼠实验饲养室，温度：（23±1）℃，相对湿度：50%～70%。喂养方式：大鼠饲养笼中给予充足的水和饲料，自由饮水进食，每笼饲养3只大鼠。

1.2试剂与仪器大黄酸（批号：20121220，纯度：≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司，经浙江中医药大学中药鉴定室鉴定属正品。大黄酸用二甲基亚砜（DMSO）溶解后，加入无血清DMEM稀释，并经0.22μm过滤消毒备用。DMSO终浓度小于0.01%；链脲佐菌素（Streptozotocin，上海源叶生物科技有限公司，批号：20121028）；人胰岛素放射免疫试剂盒（Human I125-INS RIA Kit，北京福瑞生物工程有限公司，批号：20130118012）；大鼠空腹血糖试剂盒 （德赛诊断系统上海有限公司）。普通饲料：大鼠全价营养颗粒饲料。高脂高糖饲料：基础饲料74%，猪油10%、蔗糖 10%、蛋黄 5%、胆固醇1%，并用 Co60辐照灭菌（江苏省协同医药生物工程有限责任公司）。全血血糖仪CR2032（德国罗氏公司）；全自动生化分析仪 7020（日本日立公司）；自动放免仪SN682（中国科大中佳公司）；显微镜Nikon eclipse 80（日本Nikon公司）。TNF-α、IL-1β 的ELISA试剂盒（上海吉泰生物公司）。

1.3方法

1.3.1分组与造模SD大鼠58只，适应性饲养1周，按随机数字表分为正常对照组8只和实验组50只。正常对照组给予普通饲料喂养，实验组给予高脂高糖饲料喂养，2周后禁食不禁水12小时，用0.1mmol/L枸椽酸缓冲液配置3%浓度的链脲佐菌素，按 35mg/kg的剂量一次性腹腔注射，1周后实验组大鼠禁食不禁水8小时，尾静脉采血测定血糖，筛选血糖≥16.7mmol/L的大鼠用于实验，将建模成功的糖尿病大鼠再随机分为糖尿病模型组和大黄酸（低、中、高剂量）干预组，共4组，每组10只。大黄酸干预组分别灌胃给予大黄酸25mg/（kg·d）、50mg/（kg·d）、100mg/（kg·d），正常对照组和糖尿病模型组大鼠均给予同等体积的生理盐水灌胃。每组每日上午给药1次，连续给药8周。给药期间，糖尿病模型组和各干预组大鼠继续喂予高脂高糖饲料。

1.3.2指标检测（1）空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数、TNF-α、IL-1β测定：大黄酸灌胃8周后的各组大鼠禁食12小时后，用3%戊巴比妥钠（30mg/ kg）麻醉后打开腹腔行腔静脉取血标本进行检测，包括空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）、并计算胰岛素抵抗指数（insulin resistance index，HOMA-IR），胰岛素抵抗指数以空腹血糖与空腹胰岛素乘积除以22.5表示（HOMA-IR=FBG×FINS/22.5）。运用ELISA法测定血清TNF-α、IL-1β。（2）胰腺病理切片观察：同时取各组大鼠胰腺组织 1块，大小约10mm× 10mm×2mm，10%中性甲醛液固定后经梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成厚度为5μm的切片，行苏木精-伊红染色，中性树胶固定。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件包统计，计量资料各组数据均采用（±s）来表示，各组间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验。

2　结果

2.1空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数和炎症指标与正常对照组比较，糖尿病模型组糖尿病大鼠的FBG、FINS、HOMA-IR和炎症指标TNF-α、IL-1β均有不同程度升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。低剂量大黄酸组与糖尿病模型组比较，FINS、HOMA-IR降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），两组TNF-α、IL-1β比较差异无统计学意义（P＞0.05）。中剂量和高剂量大黄酸组与糖尿病模型组比较，FBG、FINS、HOMA-IR、TNF-α、IL-1β均得到改善，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与低剂量组比较，大黄酸中剂量组的HOMA-IR、TNF-α改善明显 （P＜0.05），大黄酸高剂量组的 FBG、FINS、HOMA-IR、TNF-α、IL-1β均得到改善，差异有统计学意义（P＜0.05）。详见表1。

表1　各组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数和炎症指标的比较（±s）

表1　各组大鼠空腹血糖、胰岛素、胰岛素抵抗指数和炎症指标的比较（±s）

与正常对照组比较*P＜0.05；与糖尿病模型组比较△P＜0.05；与大黄酸低剂量组比较▲P＜0.05

组别　n　FBG（mmol/L）　FINS（Mu/L）　HOMA-IR　TNF-α（ng/mL）　IL-1β（ng/mL）正常对照组　8　9.18±0.64　35.27±2.47　14.37±1.31　14.50±4.97　0.98±0.13糖尿病模型组　10　29.06±1.88*　39.83±3.03*　51.37±4.34*　49.52±11.91*　1.99±0.48*大黄酸低剂量组　10　28.34±3.19*　36.22±3.24△　45.70±7.27*△　40.20±5.30*　1.76±0.14*大黄酸中剂量组　10　26.58±3.05*△　33.35±3.02△　39.53±6.82*△▲　32.96±5.81*△▲　1.35±042*△大黄酸高剂量组　10　25.64±2.37*△▲　31.15±2.10*△▲　35.55±4.60*△▲　19.94±6.19△▲　1.00±0.22△▲

2.2大鼠胰腺组织病理变化正常对照组胰腺细胞分布正常，核圆形，胞浆丰富，结构清楚，无变性坏死。糖尿病模型组胰岛体积缩小，细胞数目减少，间隙增大，出现明显空泡变性。大黄酸干预组与糖尿病模型组比较胰岛细胞数目有所增多，间隙减少，同时空泡变性坏死有所减少。大黄酸高剂量组较低剂量组胰岛细胞数目更多、间隙更少。详见图1。

3　讨论

糖尿病并发症的发生发展与炎症级联反应导致的胰岛素抵抗和血流动力学改变相关，抑制2型糖尿病大鼠循环中炎症细胞因子水平后，胰岛功能可以得到明显改善［1］。实验证实：胰岛素增敏剂吡格列酮可以通过活化过氧化物酶体增殖体激活受体γ（PPARγ）通道，下调转化生长因子-β1（TGF-β1）［3-4］，从而抑制炎症反应，保护肾脏的功能，独立于其调节糖脂代谢作用［5］。所以，调控糖尿病的炎症靶基因及相关信号蛋白表达，增加胰岛素敏感性，成为防治糖尿病血管并发症的靶点。

白介素家族（IL-1β、IL-18、IL-33等）是炎症反应早期阶段产生的多潜能细胞因子，其中IL-1β是引起胰岛β细胞损伤和凋亡的关键效应分子和糖尿病发病的重要驱动因素［6］，2型糖尿病大鼠给予 IL-1β受体拮抗剂处理后，组织内 CD68+和CD53+细胞浸润显著减少，循环中炎症细胞因子水平下降，胰岛功能得到明显改善［7］。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是糖尿病肾病早期病理变化的关键因子，与钠潴留和肾脏肥大相关，给予TNF-α的抑制剂治疗后，可以纠正尿白蛋白和肾小球肥大等，延缓糖尿病肾病发展［8］。

大黄具有清热燥湿作用，大黄酸是大黄的重要成分之一，属单蒽核类1，8-二羟基蒽醌衍生物，前期研究证实大黄酸可以明显改善胰岛素抵抗，降低尿白蛋白排泄量，预防血肌酐水平的升高［2］。但是具体机制不明确，限制了大黄的进一步开发和临床循证使用。

图1　光镜观察各组大鼠胰腺组织结构改变 （HE×400）（1A：正常对照组；1B：糖尿病模型组；1C：大黄酸低剂量组；1D：大黄酸中剂量组；1E：大黄酸高剂量组）

本实验结果显示：2型糖尿病大鼠模型组与正常对照组比较，炎症指标TNF-α、IL-1β均明显升高，胰岛素抵抗指数升高，胰岛细胞明显减少，间隙增大。给予大黄酸药物干预后，低剂量大黄酸组可以有效改善胰岛素抵抗，保护胰岛细胞，但是对炎症指标TNF-α、IL-1β的表达与糖尿病模型组比较差异无统计学意义，考虑大黄酸在抑制炎症改善胰岛素抵抗的作用外，可能尚有其余作用机制，如降糖、降脂、或改善其他的炎症指标，如MCP-1，ICAM-1等。中剂量和高剂量大黄酸组的 FBG、FINS、HOMA-IR、TNF-α、IL-1β较糖尿病模型组均得到明显改善，胰腺病理切片的胰岛细胞数目较糖尿病模型组明显增多，间隙减少，同时空泡变性坏死减少；同时与低剂量组比较，大黄酸高剂量组的FBG、FINS、HOMA-IR、TNF-α、IL-1β均得到改善，提示大黄酸可以通过抑制炎症指标TNF-α、IL-1β表达，改善胰岛素抵抗，同时存在剂量依赖的趋势。

上述研究证实大黄酸可以通过调控2型糖尿病大鼠TNF-α、IL-1β的表达，改善胰岛素抵抗，保护胰腺细胞，为大黄酸的进一步开发和糖尿病的防治奠定了基础。

［1］Fukui M，Tanaka M，Asano M，et al.Serum allograft inflammatoryfactor-1 isanovelmarkerfordiabetic nephropathy.Diabetes Res Clin Pract，2012，97（1）：146

［2］胡江，缪菁，段淑芳，等.大黄酸对2型糖尿病模型大鼠的保护作用.中药研究，2014，24（23），2113

［3］Tian C，Jin X，Ye X，et al.Long term intake of 0.1%ethanol decreasesserumadiponectinbysuppressingPPARγ expression via p38 MAPK pathway.Food Chem Toxicol，2014，9（65）：329

［4］ Hu C，Cong XD，Dai DZ，et al.Argirein alleviates diabetic nephropathy through attenuating NADPH oxidase，Cx43，and PERKinrenaltissue.NaunynSchmiedebergsArch Pharmacol，2011，383（3）：309

［5］Liu HF，Guo LQ，Huang YY，et al.Thiazolidinedione attenuate proteinuria and glomerulosclerosis in Adriamycin-induced nephropathy rats via slit diaphragm protection.Nephrology （Carlton），2010，15（1）：75

［6］GabayC，LamacchiaC，PalmerG.IL-1pathways in inflammation and human diseases.IL-1 pathways in inflammation and human diseases.Nat Rev Rheumatol，2010，6（4）：232

［7］Shelbaya S，Amer H，Seddik S，et al.Study of the role of interleukin-6 and highly senstive C-reative protein in diabetic nephropathy in type 1 diabetic patients.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012，16（2）：176

［8］ Wu J，Ding Y，Zhu C，et al.Urinary TNF-α and NGAL are correlated with the progression of nephropathy in patients with type 2 diabetes.Exp Ther Med，2013，6（6）：1482

浙江省自然科学基金资助项目（LY12H07004），浙江省中医药管理局基金项目（2012ZB059）。