高血压伴高同型半胱氨酸血症大鼠心肌ATF6和CHOP表达对左室肥厚的影响及依叶片干预效果

鲁轩浩，赵连友，张志敏，王继鹏，周岩芬，王增强

·论著·

高血压伴高同型半胱氨酸血症大鼠心肌ATF6和CHOP表达对左室肥厚的影响及依叶片干预效果

鲁轩浩1，赵连友1，张志敏1，王继鹏1，周岩芬1，王增强1

目的 研究高血压伴高同型半胱氨酸血症（HHcy）大鼠心肌内质网应激（ERS）时，激活作用转录因子6（ATF6）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达与左室肥厚的关系及依叶片对其干预效果。方法60只雄性SD大鼠行腹主动脉缩窄术（AAC），术后2周选收缩压（SBP）≥140 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）大鼠45只随机等分为3组。AAC组普通饲料喂养并双蒸水灌胃；对照组2.5％蛋氨酸饲料喂养并双蒸水灌胃；治疗组2.5％蛋氨酸饲料喂养并依叶片［10 mg/（kg·d）］灌胃。定期测SBP和血同型半胱氨酸（Hcy），查心脏彩超，并用免疫组化和Western blot法观察大鼠心肌ATF6和CHOP的表达。结果 术后20周，对照组大鼠SBP，血Hcy，室间隔舒张厚度（IVSD）和左室厚壁舒张厚度（LVPWD），心肌ATF6和CHOP表达均高于AAC组（P＜0.05）；治疗组大鼠SBP，血Hcy，IVSD和LVPWD，心肌ATF6和CHOP表达均明显低于对照组（P＜0.05）。结论 高血压伴HHcy大鼠心肌ATF6及CHOP表达较Hcy正常的高血压大鼠明显增高，以凋亡因子CHOP表达更占优势；依叶片有效降压，降低血Hcy，减轻心肌ERS，减缓心肌肥厚的作用。

高血压；高同型半胱氨酸血症；ATF6；CHOP；心肌肥厚；依那普利叶酸片

高血压可触发心肌细胞内质网应激（ERS），使心肌细胞内质网腔内未折叠和错误折叠蛋白聚集及钙离子平衡紊乱，应激相关因子表达增高，最终导致心肌细胞肥大及凋亡，出现左心室肥厚，但目前具体机制尚不十分清楚［1，2］。同型半胱氨酸（Hcy）是蛋氨酸循环的中间代谢产物，遗传因素和饮食因素均可使血Hcy增高，导致高同型半胱氨酸血症（HHcy）［3］。我国目前将伴有Hcy水平升高（≥10 μmol /L）的高血压称之为“H”型高血压［4］。研究发现，高达75％高血压患者伴有高同型半胱氨酸血症HHcy，且HHcy可使高血压左室肥厚程度加重，但具体机制不明［5］。研究表明，依那普利叶酸片可有效降压，同时降低血Hcy，并能减缓心肌肥厚，减轻心肌重构，改善心功能［6］，其作用机制是否与减轻内质网应激有关，尚不清楚［7］。本研究通过给予腹主动脉缩窄术（AAC）术后大鼠蛋氨酸饮食建立“H”型高血压大鼠模型，观察“H”型高血压大鼠心肌细胞ERS相关因子激活作用转录因子6（ATF6）和C/EBP同源蛋白（CHOP）的表达特点及其对左室肥厚影响，并探讨依那普利叶酸片对“H”型高血压的治疗作用和可能机制。

1　材料和方法

1.1实验材料 雄性SD大鼠60只，6～8周龄，体重160～200 g（第四军医大学实验动物中心提供）；L-甲硫氨酸（L-蛋氨酸）（美国Sigma公司）；马来酸依那普利叶酸片（依叶片）（深圳奥萨制药有限公司）；AP90 Hcy检测试剂盒（深圳奥萨制药有限公司）；兔抗大鼠ATF6抗体及兔抗大鼠CHOP抗体（英国Abcam公司）；辣根过氧化物酶标羊抗兔IgG（武汉博士德生物）；ZH-HX-Z型无创尾动脉血压测量系统（安徽江华生物仪器）；AUSA-340ⅡHcy检测仪（深圳奥萨制药有限公司）；GE VIVID7彩色多普勒超声诊断系统（美国GE公司）；DM4000型光学显微镜（德国Leica公司）。

1.2方法

1.2.1“H”型高血压大鼠模型的建立及实验分组将60只SD大鼠行腹主动脉缩窄术。手术步骤：大鼠术前禁食12 h，自由饮水，用1 ％戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定四肢。无菌条件下于大鼠剑突下1 cm，腹正中线旁0.5 cm行3～3.5 cm纵切口，逐层分离组织进入腹腔，钝性分离腹主动脉后，于左右肾动脉分支间穿入1号手术缝线，沿腹主动脉走行方向放置7号针尖磨钝的注射针头，结扎腹主动脉与针头后，抽出针头，使腹主动脉部分缩窄。腹腔注射庆大霉素0.2 ml，逐层关腹，局部消毒。术后2周选SBP≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）大鼠45只随机分为3组，每组15只。AAC组给予普通饲料喂养并给予双蒸水灌胃，对照组给予2.5％蛋氨酸饲料喂养并给予双蒸水灌胃，治疗组给予2.5％蛋氨酸饲料喂养并给予依那普利叶酸片［10mg/（kg·d）］灌胃，20周结束实验。

1.2.2各组大鼠血压测量 用无创尾动脉血压测量系统测量大鼠SBP，分别于术前，术后2周，10周，20周测量。具体步骤：用1％戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定四肢，用40℃温水局部加热鼠尾约5 min，将血压计的脉压套至大鼠尾部近心端处，高敏脉搏换能器置于尾巴中上1/3处，换能器表面对准尾巴腹侧，扣带固定。打开记录系统，测量SBP。

1.2.3血清Hcy的测定 于术前，术后10周，术后20周测量。将大鼠断尾取血2 ml，室温下放置30 min，8000 r/min 离心15 min，取上清移至EP管中，放入-80℃冰箱保存，以便分批检测血清Hcy值。取冻存血清复温至室温，用AP90 Hcy检测试剂，按照Hcy检测仪操作步骤检测血清Hcy值。

1.2.4心脏彩超测室间隔舒张厚度（IVSD）和左室后壁舒张厚度（LVPWD） 检查前禁食12 h，自由饮水，用1％戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，仰卧位固定四肢，剔除胸部毛发，探测胸骨旁左室长轴切面和左室短轴切面。超声测IVSD和LVPWD。

1.2.5免疫组化染色检测心肌细胞ATF6和CHOP的表达 心肌标本切片脱蜡后，3％双氧水处理10 min，微波炉中用0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液热修复组织抗原15 min，PBS洗涤。BSA封闭液室温封闭20 min。依次滴加1：500兔抗大鼠ATF6抗体（4℃过夜，PBS洗涤）。滴加1：500羊抗兔IgG （37℃孵育25～30 min，PBS洗涤）。DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察结果。CHOP的检测方法与ATF6相同。

1.2.6Western blot法检测ATF6和CHOP表达 心肌组织剪碎，加裂解液，置于冰上用玻璃匀浆器匀浆，静置30 min，4℃ 10000 r/min离心10min，取上清，BCA蛋白定量法测量蛋白浓度。等量蛋白质样品于SDS-PAGE凝胶恒压电泳分离，转至PVDF膜上。5％脱脂奶粉封闭后，依次滴加1：1000兔抗大鼠ATF6、CHOP抗体（4℃振荡孵育过夜，TBS洗膜5 min×3次），1：5000 HRP-羊抗兔IgG（室温振荡孵育1 h），TBS洗膜30 min，增强化学发光（ECL）曝光显影，凝胶成像分析系统行灰度扫描分析，将目的蛋白条带与内参的比值作为半定量指标。

2　结果

2.1各组大鼠SBP的比较 术前测大鼠SBP平均值为（106.2±4.3）mmHg。术后10周，AAC组、对照组及治疗组大鼠平均SBP分别为（156.6±4.0）mmHg、（157.6±3.3）mmHg、（157.4±4.6）mmHg，组间比较无明显差异（P＞0.05）。术后20周，AAC组、对照组及治疗组大鼠平均SBP分别为（161.4±5.7）mmHg、（167.0±4.7）mmHg、（117.0±6.9）mmHg，对照组平均SBP高于AAC组（P＜0.05），治疗组平均SBP明显低于对照组（P＜0.05）。

2.2各组大鼠血Hcy水平的比较 术前测大鼠血清Hcy平均值为（8.04 ±1.18）μmol/L。术后10周AAC组大鼠血Hcy为（8.40±0.96）μmol/ L，给予蛋氨酸饲料喂养后的对照组和治疗组大鼠血Hcy分别为（31.92±3.66）μmol/L和（32.30±3.67）μmol/L，均明显高于AAC组（P ＜0.01）；术后20周，AAC组、对照组和治疗组血Hcy分别为（9.02±0.59）μmol/L、（67.43± 3.26）μmol/L和（11.83±1.28）μmol/L，治疗组血Hcy显著低于对照组（P＜0.05）。

2.3各组大鼠心脏彩超的比较 术后10周各组大鼠IVSD和LVPWD高于术前，且有统计学差异（P ＜0.05），对照组和治疗组大鼠IVSD和LVPWD数值上高于AAC组，但无统计学差异（P＞0.05）。术后20周，对照组大鼠IVSD和LVPWD显著高于AAC组（P＜0.05）；治疗组大鼠IVSD和LVPWD明显低于对照组（P＜0.05）（表1、表2）。

表1　术前及术后10周大鼠心脏超声检测结果（n=15，±s，mm）

表1　术前及术后10周大鼠心脏超声检测结果（n=15，±s，mm）

注：各组与术前比较，aP＜0.05

指标术前AAC组术后10周对照组术后10周治疗组术后10周IVSD1.43±0.19 1.66±0.11a1.74±0.11a1.75±0.09aLVPWD 1.71±0.23 1.89±0.20b1.95±0.08c1.96±0.10c

表2　术后20周大鼠心脏超声检测结果（n=15，±s，mm）

表2　术后20周大鼠心脏超声检测结果（n=15，±s，mm）

注：与AAC组比较，aP＜0.01；对照组比较，bP＜0.05

指标AAC组对照组治疗组IVSD1.89±0.102.12±0.14a1.91±0.07bLVPWD2.05±0.142.33±0.12a2.05±0.11b

2.4各组大鼠心肌细胞中ATF6和CHOP免疫组化染色 大鼠心肌细胞ATF6和CHOP均表达在胞浆中，呈棕黄色颗粒。对照组大鼠心肌细胞内可见大量棕黄色颗粒，ATF6和CHOP呈强阳性表达；AAC组大鼠心肌细胞内可见中等量棕黄色颗粒，ATF6和CHOP呈阳性表达；治疗组大鼠心肌细胞内可见少量棕黄色颗粒，ATF6和CHOP呈弱阳性表达（图1、图2）。

2.5Western blot法检测各组大鼠心肌细胞中ATF6和CHOP表达水平 AAC组大鼠心肌ATF6和CHOP的表达水平均低于对照组（P＜0.05）。治疗组大鼠心肌ATF6和CHOP的表达水平均低于对照组及AAC组（P＜0.05）（图3～6）。

3　讨论

图1　各组大鼠心肌细胞ATF6免疫组化染色［×400；A：对照组；B：AAC组；C：治疗组］

图2　各组大鼠心肌细胞CHOP免疫组化染色［×400；A：对照组；B：AAC组；C：治疗组］

图3　Western blot法检测各组大鼠心肌细胞ATF6的表达

图4　Western blot法检测各组大鼠心肌细胞ATF6的表达［与对照组比较，aP＜0.05；与AAC组比较，bP＜0.05］

图5　Western blot法检测各组大鼠心肌细胞CHOP的表达

图6　Western blot法检测各组大鼠心肌细胞CHOP的表达［与对照组比较，aP＜0.05；与AAC组比较，bP＜0.05］

高血压是心脑血管疾病最主要的危险因素之一，也是心脑血管疾病死亡的重要原因。流行病学调查显示，2002年我国成年人高血压患病率达18.8％，而《中国心血管病报告2015》指出我国18岁以上居民高血压患病率为25.2％，呈上升趋势。而高血压患者中，有3/4的患者同时伴有HHcy，研究表明［8］，Hcy水平的升高可使高血压危险性成倍增加。高血压可引起左室心肌肥厚，而HHcy可促使高血压左室肥厚程度加重，但具体机制不明，可能与心肌内质网应激有关。有研究表明［9］，内质网应激作为一种细胞信号通路，参与了高血压左室肥厚发生发展的全程。心肌细胞在各种理化因素的刺激下，内质网腔内未折叠和错误折叠的蛋白增多以及钙离子失调，会诱发内质网应激。其过程主要为内质网伴侣糖调节蛋白GRP78/Bip与未折叠蛋白结合，促使PERK、ATF6和IRE1释放，减轻内质网应激，恢复细胞内稳态。当内质网应激较剧烈或者在应激时程延长时则可触发细胞损伤信号通路导致细胞更加严重的损伤甚至细胞凋亡。其主要是通过诱导CHOP/GADD153表达、JNKs及Capase-12的活化导致细胞凋亡。依那普利叶酸片是一种新型复方制剂降压药，研究证明［10］，该药可控制血压并降低血Hcy水平，并能逆转心肌肥厚，其作用机制中，可能与减轻内质网应激有关，但其机制尚不清楚。

有文献报道［11］，给予大鼠高蛋氨酸饮食后，可致血清Hcy水平升高。本研究通过AAC手术建立高血压大鼠模型，术后2周，大鼠SBP＞140 mmHg。在此基础上，给予大鼠2.5％的高蛋氨酸饮食，饲养8周后，血清Hcy水平较前明显增高，成功建立“H”型高血压大鼠模型。术后10周，各组大鼠平均SBP无明显差别，对照组和治疗组大鼠IVSD和LVPWD数值较AAC组高，但无统计学差异，说明HHcy在短时间内对血压和左室肥厚的影响并不明显。术后20周，对照组平均SBP、IVSD和LVPWD均高于AAC组，提示随时间延长，HHcy可加重左室肥厚，并可导致SBP进一步增高。治疗组平均SBP降至正常，血Hcy浓度较对照组明显减低，IVSD和LVPWD较对照组低，而与AAC组无明显差别，说明依那普利叶酸片可有效降低SBP和血Hcy水平，减缓心肌肥厚。根据免疫组化和Western Blot的结果分析发现：①术后20周，对照组和AAC组大鼠心肌细胞内ATF6和CHOP的表达均增高明显，以凋亡因子CHOP表达占优势，说明持续的血压增高，会激活ERS凋亡途径，而对照组ATF6和CHOP的表达较AAC组增高更明显，说明HHcy加重了ERS；②治疗组心肌细胞ATF6和CHOP表达较对照组明显减低，以保护性因子ATF6表达占优势，表明依那普利叶酸片减缓心肌肥厚作用机制，可能与减轻心肌细胞ERS有关。

综上所述，高血压可引起大鼠心肌细胞ERS，在应激起始阶段，以保护性因子ATF6表达占优势，但如果血压持续升高，随着应激时间延长，长期的压力负荷过高，会激活内质网相关的凋亡信号途径，导致保护性因子ATF6和促凋亡因子CHOP表达的失衡，以凋亡因子CHOP的表达更占优势，引起心肌肥厚。而血Hcy浓度增高，会加重高血压心肌细胞ERS，导致左室肥厚进一步加重。依那普利叶酸片可显著降低血压和血Hcy浓度，心肌细胞ERS相关因子ATF6和CHOP表达均明显降低，以保护性因子ATF6表达占优势，减缓心肌肥厚。故认为HHcy可加重高血压致左室肥厚，其分子机制可能与加重心肌细胞ERS有关，依叶片减缓心肌肥厚的部分作用机制可能与减轻心肌细胞ERS有关。但HHcy是否还可通过其他途径加重心肌肥厚，及单纯的HHcy是否会激活ERS凋亡通路，还有待进一步研究。

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本文编辑：田国祥

Influences ofATF6 and CHOP expression on left ventricular hypertrophy in hypertensive rats with hyperhomocystinemia and the effect of enalapril folic acid tablets intervention

LU Xuan-hao*，ZHAO Lian- you，ZHANG Zhi-min，WANG Ji-peng，ZHOU Yan-fen，WANG Zeng-qiang. *Department of Cardiology， Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University， Shaanxi， Xi'an，710038， China.

ZHAO Lian-you，Email：zhaolyfmmu@126.com

Objective To Study the relationship between changes of activating transcription factor6 （ATF6） and C/EBP homologous protein （CHOP） expression with left ventricular hypertrophyin hypertension rats withhyperhomocy stinemia（HHcy） on myocardial endoplasmic reticulum stress（ERS），and observe the effect of enalapril folic acid tablets reversal left ventricular hypertrophy. Methods 60 male SD rats underwent abdominal aortic constriction （AAC）. Two weeks after operation，45 ratswhich systolic blood pressure（SBP）＞140 mmHg were randomly divided into 3 groups. The AAC group was given normal diet and lavaged double distilled water； the control group was given 2.5％ methionine diet and lavaged double distilled water； the treatment group received 2.5％ methionine diet and lavaged enalapril folic acid tablets （10 mg/kg/d）. SBP and blood homocysteine （Hcy） were measured regularly， echocardiographyexam ination was conducted， and the expression level of rat myocardial ATF6 protein and CHOP protein were detected by immunohistochemical and Western blot. Results 20 weeks after operation，the SBP， blood Hcy， inlet ventricular septal defect（IVSD） and left ventricular posterior wall diameter（LVPWD）， expression of myocardial ATF6 and CHOPin the control group were higher than those in the AAC group （P＜0.05）； the SBP，blood Hcy， IVSD and LVPWD， myocardial ATF6 and CHOP expression in the treatment group were significantly lower than those in the control group （P＜0.05）. Conclusion Myocardial ATF6 and CHOP expressionin hypertension rats with HHcy was significantly higher than that in hypertensive ratswith normal Hcy， and CHOP expression was more dominant. Enalapril folic acid tablets can effectively reduce blood pressure and Hcy， mitigate myocardial ERS， relieve the myocardial hypertrophy.

Hypertension； Hyperhomocystinemia； ATF6； CHOP； Myocardial hypertrophy； Enalapril folic acid tablets.

R544.1

A

1674-4055（2016）06-0729-04

1710038 西安，第四军医大学唐都医院心内科

赵连友，E-mail：zhaolyfmmu@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.06.26