无翅型MMTV整合位点家族成员5A/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2在大鼠牙囊细胞中的表达及其意义

王丽萍　李伯琦　王琪　铁晓敏　刘奕杉

新疆医科大学第一附属医院儿童口腔科-口腔预防科，乌鲁木齐 830000

无翅型MMTV整合位点家族成员5A/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2在大鼠牙囊细胞中的表达及其意义

王丽萍李伯琦王琪铁晓敏刘奕杉

新疆医科大学第一附属医院儿童口腔科-口腔预防科，乌鲁木齐 830000

目的观察在牙齿正常萌出过程中无翅型MMTV整合位点家族成员5A（Wnt5A）/受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（Ror2）信号在大鼠体内外牙囊细胞表达的特点，探讨其与成熟破骨细胞形成及牙齿萌出的相关性。方法分离出生后1～13 d的SD大鼠下颌骨，苏木精-伊红染色观察牙囊及牙槽骨生长发育过程，免疫组织化学法观察在下颌第一磨牙萌出过程中Wnt5A和Ror2在牙囊细胞中的表达。体外培养出生后5～6 d的SD大鼠第一磨牙牙囊细胞，免疫组织化学法观察Wnt5A、Ror2在牙囊细胞中的表达。结果SD大鼠出生后第2天牙囊开始分化为牙周组织，1～3 d牙槽骨变化不明显，第4天起，破骨细胞数量明显增多。Wnt5A在出生后第1～3天的大鼠牙囊组织内无明显表达，第4天开始出现阳性表达，并持续表达至第13天。Ror2在出生后第1～3天的大鼠牙囊组织表达呈强阳性，而在第4～13天呈弱阳性。结论Wnt5A、Ror2在牙萌出过程中有特定的时间分布，提示其可能参与牙齿萌出的调控。

无翅型MMTV整合位点家族成员5A；受体酪氨酸激酶样孤儿受体2；牙囊；破骨细胞

无翅型MMTV整合位点家族成员（wingless-type MMTV integration site family member，Wnt）是一类对生长发育和生理病理过程有着重要作用的蛋白。无翅型MMTV整合位点家族成员5A（wingless-type MMTV integration site family，member 5A，Wnt5A）是Wnt家族中重要成员之一，也是激活非经典Wnt信号通路的重要蛋白，主要功能是参与细胞间的信号传递［1］。

受体酪氨酸激酶样孤儿受体2（receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2，Ror2）是酪氨酸激酶受体家族中的重要成员之一，其在骨骼分化、组织细胞迁移及神经系统发育等方面都发挥着重要的调控作用［2］。Nishita等［3］研究显示，Ror2对Wnt5A信号通路的激活具有特异性。

近年来，口腔医学领域对Wnt5A的研究逐步深入，包括牙齿的生长发育、颌面部畸形、口腔肿瘤、牙周炎等［4-6］。Maeda等［7］发现Wnt5A-Ror2信号途径在成骨细胞谱系细胞向破骨细胞前体转化过程中促进破骨细胞发生，为原发性萌出异常等疾病提供治疗方向。本研究拟用SD大鼠作为研究对象，初步探讨Wnt5A/Ror2信号通路在牙齿萌出过程中的作用。

1　材料和方法

1.1主要试剂和仪器

胎牛血清（HyClone公司，澳洲），DMEM、胰蛋白酶（HyClone公司，美国），Ⅰ型胶原酶（Sigma公司，美国），兔抗Wnt5A抗体（ThermoFisher公司，美国），兔抗Ror2抗体、二步法免疫组化检测系统、DAB染色液、抗体稀释液、进口羊血清、进口脱钙液（北京中杉金桥生物技术有限公司），倒置显微镜、正置显微镜（莱卡公司，德国）。

1.2苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色

取出生后1～13 d龄的SD仔鼠各3只（雌雄、体质不限，由新疆医科大学动物实验中心提供正常饲养），引颈处死，取出下颌骨，截取第一磨牙牙胚段，置入4%多聚甲醛溶液4 ℃固定24 h，再置入脱钙液4 ℃下脱矿1～3周不等，不同梯度乙醇脱水，石蜡包埋，并分别制作4 μm厚的石蜡切片各6张。

1.3免疫组织化学染色

1.3.1组织切片分别取出生后1～13 d龄的组织切片各3张作为实验组。65 ℃烤片2 h，常规脱蜡至水；滴加3%H2O2溶液，灭活内源性酶；置于0.01 mol·L-1柠檬酸钠缓冲液，微波抗原修复12 min；滴加血清封闭液，室温20 min；实验组滴加兔抗大鼠Wnt5A一抗，4 ℃过夜；滴加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃温箱25 min；DAB显色2～3 min，蒸馏水洗涤；苏木素复染；脱水透明，中性树胶封片，正置显微镜下观察。阴性对照组以PBS代替一抗，滴加在出生后9 d的组织切片上，其余处理同实验组。Ror2的表达检测同Wnt5A。

1.3.2牙囊细胞参考凌均棨等［8］的方法，分离5～6 d SD大鼠下颌第一磨牙胚，获取牙囊组织并培养牙囊细胞，选取铺满培养皿60%～70%的P3代牙囊细胞，PBS冲洗3遍，4 ℃温度下用4%多聚甲醛固定20 min，含0.5%Triton X-100是室温下透化5～10 min，滴加血清封闭液37 ℃温箱30 min；实验组滴加兔抗大鼠Wnt5A一抗，对照组滴加等量PBS，4 ℃过夜；滴加生物素化兔抗山羊IgG，37 ℃温箱25 min；DAB显色，显微镜下观察终止。Ror2的表达检测同Wnt5A。

1.3.3结果判定阳性表达呈黄色至棕褐色颗粒，按有无表达和染色深浅程度，分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性。阴性无表达，弱阳性为浅黄色或浅棕色，强阳性呈深黄或棕褐色。

2　结果

2.1下颌第一磨牙萌出过程中牙齿和牙周的形态学变化

牙齿萌出过程中下颌第一磨牙的形态学改变见图1。

图1　牙齿萌出过程中下颌第一磨牙的形态学改变　HE　× 50Fig　1　Morphological changes of the mandibular first molar in the process of tooth eruption　HE　× 50

由图1可见，出生第1天的大鼠，下颌第一磨牙周围可见幼稚的多层牙囊细胞；第2天开始，可见牙囊细胞分化为牙周组织；第7天可见牙周纤维明显增多，牙囊细胞层次减少，多核的破骨细胞呈粉红色，胞核内含1～2个核仁，胞核呈浅蓝色，细胞质内还可见大小不等的空泡。1～13 d牙槽骨中可观察到破骨细胞持续出现，但出生后第3天和第9天可见破骨细胞数量相对较多。

2.2Wnt5A在大鼠下颌第一磨牙牙囊中的表达

Wnt5A在出生后第1～3天的大鼠牙囊组织中无表达；在出生后第4天，可见牙囊组织呈黄褐色，提示Wnt5A表达（图2）；在出生后第4～13天，Wnt5A在牙囊组织中持续表达阳性。P3代牙囊细胞Wnt5A免疫组织化学染色阳性表达（图3），与组织切片相吻合。

2.3Ror2在大鼠下颌第一磨牙牙囊中的表达

Ror2在出生后第1～3天的大鼠牙囊组织中呈强阳性表达；在出生后第4～13天，Ror2在牙囊组织中呈弱阳性表达（图4）；P3代牙囊细胞Ror2呈弱阳性，与组织切片相吻合（图3）。

图2　Wnt5A在牙齿萌出过程中的表达　IHC　× 200Fig　2　The expression of Wnt5A in the process of tooth eruption　IHC　× 200

图3　牙囊细胞（P3代）Wnt5A、Ror2表达呈阳性　IHC　× 100Fig　3　The expression of Wnt5A and Ror2 in dental follicle cells （P3） was positive　IHC　× 100

图4　Ror2在牙齿萌出过程中的表达　IHC　× 200Fig　4　The expression of Ror2 in the process of tooth eruption　IHC　× 200

3　讨论

牙齿早萌或迟萌，如诞生牙和恒牙异位早萌、乳牙滞留和恒牙迟萌是错畸形的常见病因之一，影响恒牙正常排列及正常建立，严重影响患者正常口腔生理功能、颜面部美观和心理健康。目前牙齿早萌或迟萌分子机制不清楚，可能涉及两大方面:第一，牙槽骨或乳牙牙根吸收不协调；第二，牙齿萌出动力不足，涉及恒牙胚牙周膜、根尖组织、牙髓及牙囊发育等多因素的相互作用［9］。解决牙齿早萌或迟萌的重要前提是弄清牙齿正常萌出的分子机制。牙槽骨吸收形成萌出通道是牙齿萌出的必要前提条件［10］，该生理过程与破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞密切相关。成熟破骨细胞则是牙槽骨吸收的执行细胞。然而，牙齿萌出过程中启动牙囊内破骨前体细胞分化为成熟破骨细胞的关键信号分子不明确。为弄清牙齿萌出机制，关键科学问题之一就在于明确牙囊内破骨前体细胞如何分化为成熟破骨细胞的分子机制。

破骨细胞从起源发育至成熟，再经活化发挥吸收作用是一个复杂的多级调控过程，始终都受到一系列细胞因子的影响。有些细胞因子对破骨细胞的成熟分化起促进作用，如核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、1，25-（OH）2D3、甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）等，其中RANKL 和M-CSF是破骨细胞形成和分化过程中两个必需的因子；有些因子起抑制作用，如骨保护素（osteoprotegerin，OPG）、IL-4、IL-10、雌激素、降钙素、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等。OPG/核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）/RANKL系统在破骨细胞分化成熟过程中起着枢纽作用，大部分细胞因子都直接或间接地通过OPG/RANK/RANKL系统来发挥作用。介导破骨细胞分化成熟的各种细胞因子反应的信号传导路径主要包括丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、钙调磷酸酶（calcineurin，CN）/活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）、活化T细胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells，cytplasmic 1，NFATc1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）等通路［11］，全面地了解破骨细胞因子及其信号传导通路，将有助于临床更好地分析牙齿早萌或迟萌等各种骨代谢性疾病的病因及发病机制，进而为治疗提供理论依据。

Wnt5A/Ror2信号通路被认为在肿瘤，特别是骨肉瘤、前列腺癌等恶性肿瘤的转移、预后等中发挥重要作用［12-16］。关于Wnt5A对骨质疏松这方面的影响，很多人考虑是其对成骨细胞的抑制，而骨的形成是成骨细胞和破骨细胞的调节作用，Maeda等［7］研究发现成骨细胞系细胞和破骨细胞前体表达Wnt5A 和Ror2，Ror2信号在破骨细胞前体高表达，并且增强RANKL的表达进而促进破骨细胞的形成。Wnt5A促进RANKL诱导破骨细胞形成。杨婷［5］研究发现骨髓间充质干细胞中的Wnt5A/Ror2信号可上调RANKL的表达，RANKL与RANK结合后可激活破骨前体细胞中的Ca2+/NFAT通路，促进破骨细胞的形成。

本实验中通过HE染色方法，观察到SD大鼠出生后1～13 d破骨细胞持续出现，在出生后第3天与第9天均有明显的增加，这与Wise等［17］的研究结果相一致。通过免疫组织化学方法，观察到Wnt5A、Ror2在牙萌出过程中有特定的时间分布，二者的变化与成熟破骨细胞的形成相吻合，提示Wnt5A、Ror2是牙齿萌出的调控因子，其可能通过调控牙囊内破骨前体细胞分化成熟，促进生理状态下的骨吸收，进而导致牙齿萌出。因此，Wnt5A/Ror2信号通路在牙齿萌出过程中，具有重要的理论价值和实际意义。但Wnt5A/Ror2信号通路在牙囊内调控破骨前体细胞分化成熟的具体分子机制尚不清楚，还有待进一步研究，为解释牙萌出提供新的理论依据。

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（本文采编王晴）

Expression and significance of wingless-type MMTV integration site family， member 5A/receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 in the rat dental follicle

Wang Liping， Li Boqi， Wang Qi， Tie Xiaomin， Liu Yishan.（Dept. of Pediatric Dentistry and Preventive Dentistry， The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China）
Supported by: The National Natural Science Foundation of China（81560178）. Correspondence: Liu Yishan， E-mail: lys-tree @126.com.

ObjectiveTo observe the expression of wingless-type MMTV integration site family， member 5A （Wnt5A）/ receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2 （Ror2） signal in the dental follicle cells during the normal eruption of the teeth as well as to explore the relationship between the expression of dental follicle cells and the formation of mature osteoclasts and eruption of the teeth. MethodsThe mandibulars of 1-13 d old SD rats were separated to observe the growth and development of the teeth and alveolar bone through hematoxylin-eosin（HE） staining. Ror2 and Wnt5A expressions in rat dental follicle were also observed through immunohistochemistry. Dental follicle cells from the lower first intact molar germs of 5-6-day old SD rats were separated and cultured. ResultsOn the second day after birth， the dental follicle began to differentiate into periodontal tissues， but no obvious changes were observed in the alveolar bone one to three days after birth. On the fourth day， the number of osteoclasts increased significantly. The results of immunohistochemistry showed that Wnt5A was not significantly expressed in rat dental follicle tissues before the fourth day， but positive expression was expressed in the next day and continued to express to thirteenth days. Ror2 was expressed in the rat dental follicle at postnatal days 1-3， but weak expression was found in days 4-13. ConclusionWnt5A and Ror2 expressions in the process of tooth eruption have specific time distributions， suggesting that these expressions may participate in the regulation of the eruption of the teeth.

wingless-type MMTV integration site family， member 5A；receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2；dental follicle；osteoclast

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2016.04.004

2016-01-05；

2016-05-18

国家自然科学基金（81560178）

王丽萍，硕士，E-mail:775392934@qq.com

刘奕杉，主任医师，硕士，E-mail:lys-tree@126.com