涎腺腺样囊性癌中BNIP3蛋白的表达及临床意义分析

陈占伟　孙杜斌　黄圣运　吴海威　张东升

1.山东大学附属省立医院口腔颌面外科，济南 250021；2.邹城市人民医院口腔科，济宁 273500

涎腺腺样囊性癌中BNIP3蛋白的表达及临床意义分析

陈占伟1孙杜斌2黄圣运1吴海威1张东升1

1.山东大学附属省立医院口腔颌面外科，济南 250021；2.邹城市人民医院口腔科，济宁 273500

目的研究促凋亡蛋白BNIP3在涎腺腺样囊性癌（SACC）中的表达以及与临床病理特征及患者预后的关系，探讨其在腺样囊性癌低氧自噬中的作用。方法采用免疫组织化学法检测65例SACC患者中BNIP3、低氧诱导因子（HIF）-1α和LC3的蛋白表达，分析BNIP3表达与SACC临床病理特征之间的关系及其与HIF-1α、LC3表达的相关性，并对患者生存率进行单因素生存分析。结果BNIP3在41例SACC中阳性表达（63.1%），其表达的高低与组织学分级相关（P=0.001）。BNIP3与HIF-1α的表达相关（P=0.011），与LC3的表达无明显相关性（P=0.167）。BNIP3阴性表达组的总体存活率高于BNIP3阳性表达组（P＜0.05）。结论BNIP3在SACC的发生、发展中可能发挥着重要作用，为SACC的基因靶向治疗提供了新的治疗方向。

腺样囊性癌；BNIP3蛋白；低氧；低氧诱导因子；自噬

涎腺腺样囊性癌（salivary adenoid cystic carci-noma，SACC）是恶性唾液腺肿瘤中的常见类型，约占所有唾液腺肿瘤的10%，占所有恶性唾液腺肿瘤中的22%［1］。现阶段对于腺样囊性癌的治疗方案主要是以根治手术为主，同时辅以放疗的综合序列治疗，但腺样囊性癌的总体疗效仍不能让人满意。

低氧作为实体肿瘤微环境中常见的现象，对于肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭以及血管生成有重要的作用。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1是在低氧条件下重要的转录因子，其中HIF-1α是HIF-1的功能亚基，已经在多数癌症中观察到，并与不良预后及治疗抵抗相关［2-3］。既往研究发现，HIF-1α在涎腺腺样囊性癌中广泛表达，而在肿瘤附近正常涎腺腺体组织中鲜有表达。BNIP3，即Bcl2/腺病毒E1B相对分子质量为19×103的相关蛋白3（Bcl-2/adenovirus E1B 19×103interacting protein 3），属于促凋亡蛋白，其表达受HIF-1α依赖的缺氧的调节及其他很多因素的影响。BNIP3蛋白主要定位于线粒体外膜，当其被激活后，完全整合入线粒体外膜，通过开放线粒体通透性转运孔损伤线粒体功能引起染色质凝聚、DNA分解，最终导致细胞凋亡。BNIP3的异常表达和很多肿瘤的进展、化疗耐药及自噬密切相关。BNIP3的表达受到转录因子HIF-1α的调控，在低氧诱导细胞自噬凋亡过程中起重要的作用。然而，涎腺腺样囊性癌中BNIP3蛋白的表达及其调节的低氧诱导自噬通路和临床病理学行为尚未有报道。本实验通过对腺样囊性癌组织和细胞中BNIP3以及低氧相关蛋白HIF-1α和自噬相关蛋白LC3的检测，探索其在腺样囊性癌低氧自噬中的作用，同时分析BNIP3的表达在腺样囊性癌研究中的临床意义，为腺样囊性癌的基因靶向治疗寻找新的治疗方向。

1　材料和方法

1.1研究对象

对2002—2011年期间于山东大学附属省立医院口腔颌面外科进行肿瘤切除手术的65例涎腺腺样囊性癌病例（所有病例术前均未进行放射治疗或者化疗）进行整理回顾，所选病理标本均由山东大学附属山东省立医院病理科病理证实为腺样囊性癌，所有患者临床病理资料及术后随访资料完整。65例患者中，女性26例，男性39例，平均年龄48.2岁（18～75岁）。肿瘤平均大小1.9 cm（0.6～4.5 cm）。根据美国联合癌症分类委员会制定的最新肿瘤分期标准对肿瘤进行临床TNM分期。组织学分级为:Ⅰ级，肿瘤中主要为管状型和（或）筛孔型两种病理类型，无实体型存在；Ⅱ级，肿瘤中存在管状型和（或）筛孔型，但实体型成分小于等于30%；Ⅲ级，肿瘤中管状型和筛孔型较少见，以实体型为主［4］。

1.2免疫组织化学染色检测腺样囊性癌中BNIP3、HIF-1α和LC3的蛋白表达

采用免疫组织化学EnvisionTM二步法，操作步骤按说明书进行，一抗为鼠抗人BNIP3单克隆抗体（1∶100，Santa Cruz公司，美国）、兔抗人LC3A/ B多克隆抗体（1∶200，Abcam公司，英国）、兔抗人HIF-1α多克隆抗体（1∶50，武汉博士德生物工程有限公司），二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗、DAB显色剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）。4 μm厚白片经脱蜡水化后，其中BNIP3、LC3应用枸橼酸缓冲液（pH 6.0）、HIF-1α应用EDTA（pH 9.0）高压水浴加热，进行抗原修复20 min，室温冷却后，滴加3%过氧化氢温箱孵育30 min以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜；次日提前1 h取出复温，PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗5 min×3 次；DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精衬染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。用PBS取代一抗作为空白对照。

判断标准:BNIP3的表达一般定位于胞浆内，而HIF-1α和LC3可同时表达于细胞胞浆或者细胞核内，本实验仅评价细胞核内HIF-1α的表达以及细胞浆内LC3的表达。参考现有免疫评价标准，根据整个切片中阳性的强度和面积对每例病例进行评分，阳性强度分为无（0分）、弱（1分）、中（2分）、强（3分）4个级别，阳性面积分为＜10%（0分）、10%～49%（1分）、≥50%（2分）。对于HIF-1α的评估，由于其核染色的特殊性，将阳性表达率小于30%视为阴性表达，阳性表达率大于等于30%视为阳性表达。结果评判由2名医师进行双盲读片确定。

1.3统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。采用Pearson χ2检验或连续矫正的χ2检验对SACC组织中BNIP3表达与患者的临床病理特征参数之间的关系进行比较，对BNIP3与HIF-1α、LC3表达的相关性进行分析。采用Kaplan-Meier法对患者生存率进行单因素生存分析，差异显著性采用Log-Rank检验。

2　结果

2.1BNIP3在腺样囊性癌中的表达以及与临床病理特征的关系

BNIP3在正常唾液腺细胞中呈阴性表达，而在SACC 3种不同的组织病理类型（筛孔、管状和实体型）中均可观察到BNIP3的阳性表达（图1）。BNIP3 在65例腺样囊性癌中有41例阳性表达（63.1%），其表达的高低与组织学分级相关（P=0.001），而与年龄、性别、TNM分期、肿瘤大小和远处转移无明显相关性（表1）。

图1　BNIP3的表达　免疫组织化学染色　× 200Fig　1　The expression of BNIP3　immunohistochemical staining　× 200

表1　BNIP3与腺样囊性癌临床病理特征之间的关系Tab　1　Correlation between BNIP3 expression and the clinicopathologic variables in SACC

2.2BNIP3与HIF-1α、LC3表达的相关性

BNIP3与HIF-1α、LC3的表达相关性见表2、3。BNIP3与HIF-1α的表达相关（P=0.011），与LC3的表达无明显相关性（P=0.167）。

表2　BNIP3与HIF-1α的表达相关性Tab　2　Correlation between BNIP3 and HIF-1α expression in SACC

2.3生存率分析

65例患者平均随访时间为63个月（18～115个月），30例患者死于本病，33例患者仍然存活，2例失访。Kaplan-Meier法和Log-Rank检验结果表明，BNIP3阴性表达组的总体存活率高于BNIP3阳性表达组（P＜0.05）（图2）。

表3　BNIP与LC3的表达相关性Tab　3　Correlation between BNIP3 and LC3 expression in SACC

图2　Kaplan-Meier法分析BNIP3阴性与阳性表达组腺样囊性癌患者的生存率曲线Fig　2　Kaplan-Meier survival estimate for cumulative survival rate of patients with SACC according to BNIP3 negative and positive expression

3　讨论

BNIP3是Bcl-2家族的促凋亡成员，可以与其他Bcl-2家族促凋亡成员相互作用。BNIP3含有多个结构功能域，其中发挥重要功能作用的就是BH3域，BNIP3可以通过BH3域与其他蛋白发生交互作用。BNIP3已经被证实是低氧状态细胞应对外界压力的重要作用基因。BNIP3的启动子含有一个缺氧反应元件，而该结构是HIF-1转录调节的重要靶点，因此BNIP3被视为HIF-1α调节的重要下游基因。目前关于BNIP3是原癌基因还是抑癌基因的争论很多。研究表明，BNIP3在胰腺癌［5］、结肠直肠癌和胃癌［6］、造血恶性肿瘤［7］中低表达而在非小细胞肺癌［8］、基底细胞癌［9］、胆管癌［10］中高表达。学者［11］指出，BNIP3可在乳腺癌诱发进展过程中的不同阶段发挥完全相反的作用。虽然在人体多种恶性肿瘤中均有研究，但是对于BNIP3在涎腺腺样囊性癌中的角色认识仍然十分有限。

本实验证实，BNIP3在正常唾液腺组织中呈阴性表达，而在SACC 3种不同病理类型中呈阳性表达，且与组织病理学分级相关。组织学Ⅲ级、细胞分化差的肿瘤组织中，BNIP3的表达显著高于细胞分化较好的组织学Ⅰ级和Ⅱ级。另外，BNIP3阴性表达组的总体存活率比BNIP3阳性表达组更高。这一特点与肿瘤的恶性程度一致，提示BNIP3在腺样囊性癌的发生、发展中可能发挥着重要作用。

本实验同时也探究了HIF-1α与LC3在腺样囊性癌中的表达，结果发现在腺样囊性癌细胞中HIF-1α/ BNIP3通路调节的低氧自噬可能在腺样囊性癌中发挥着重要作用。本课题前期体外实验中通过模拟低氧状态刺激腺样囊性癌细胞发现，细胞中HIF-1α/ BNIP3通路活性明显上调，并且细胞自噬水平也明显提高，这表明BNIP3可能在腺样囊性癌的低氧自噬中有重要作用。然而，本实验中发现BNIP3的表达与LC3的表达并不相关。事实上，本研究发现低氧诱导自噬的通路十分复杂，不同缺氧调节下调节低氧自噬的信号通路也不相同，一般来说当细胞处于极度缺氧条件下，除上述依赖HIF-1α/BNIP3信号通路调节活化的低氧自噬外，非HIF-1α依赖的低氧自噬通路也起着十分关键的作用。通过对极度低氧状态的研究发现，在极度低氧甚至乏氧状态下AMPK信号通路和UPR信号通路的活化可以诱导自噬的发生［12］。因此，笔者推测在腺样囊性癌组织中的不同部位低氧环境不同从而导致不同的信号通路活化，这也就解释了为什么在腺样囊性癌组织中BNIP3和LC3表达不相关的原因。

综上所述，BNIP3可能在涎腺腺样囊性癌的诱发进展过程中扮演重要的角色，而且BNIP3可能成为腺样囊性癌的一个新的预后因子，作为一种新的腺样囊性癌肿瘤标记物在未来的生物治疗中起到重要作用。

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（本文编辑李彩）

Analysis of BNIP3 expression and clinical research in salivary adenoid cystic carcinoma

Chen Zhanwei1， Sun Dubin2，Huang Shengyun1， Wu Haiwei1， Zhang Dongsheng1.（1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University， Jinan 250021， China； 2. Dept. of Stomatology， The People's Hospital of Zoucheng City， Jining 273500， China）
Supported by: The Natural Science Foundation of Shandong Province （ZR2012HQ022）. Correspondence: Zhang Dongsheng，E-mail: ds63zhang@163.com.

ObjectiveThis study investigated the expression of BNIP3 in salivary adenoid cystic carcinoma （SACC） and its correlations to the clinicopathological features and prognosis of patients with SACC. The role of BNIP3 in the progress of hypoxia-induced autophagy was elucidated. MethodsThe expression levels of BNIP3， hypoxia inducible factor （HIF）-1α，and LC3 in 65 SACC cases were detected by immunohistochemical staining method， and the correlation between the expression of BNIP3 and the clinicopathological features in SACC was analyzed. In addition， the correlations of BNIP3 gene expression with HIF-1α and LC3 gene expression were analyzed. The survival rate of patients with SACC was evaluated by univariate survival analysis. ResultsBNIP3 was considerably expressed in SACC in all three histological patterns， and was positive in 41 cases （63.1%）. BNIP3 gene expression was significantly correlated with histological grade （P=0.001） and HIF-1α gene expression （P=0.011）. By contrast， BNIP3 gene expression was not significantly correlated with LC3 gene expression （P= 0.167）. The overall survival rate of patients with negative BNIP3 expression was better than that of patients with positive BNIP3 expression （P＜0.05）. ConclusionBNIP3 might play a vital role in the tumorigenesis of SACC and may be a new target for gene therapy.

adenoid cystic carcinoma；BNIP3；hypoxia；hypoxia inducible factor；autophagy

R 739.81

A

10.7518/hxkq.2016.04.017

2015-11-16；

2016-01-18

山东省自然科学基金（ZR2012HQ022）

陈占伟，主治医师，博士，E-mail:chzhanwei@126.com

张东升，教授，博士，E-mail:ds63zhang@163.com