上皮膜蛋白1真核表达载体的构建及其对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

代晓华　张军　邹慧儒　连小丽　李燕妮　王冠华　颜艳

1.天津市口腔医院·南开大学口腔医院中心实验室；2.颌面外科，天津 300041

·口腔肿瘤学专栏·

上皮膜蛋白1真核表达载体的构建及其对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响

代晓华1张军2邹慧儒1连小丽1李燕妮1王冠华1颜艳1

1.天津市口腔医院·南开大学口腔医院中心实验室；2.颌面外科，天津 300041

目的构建上皮膜蛋白1（EMP1）基因真核表达载体pEGFP-N1-EMP1，探讨EMP1基因对人舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的影响。方法采用逆转录聚合酶链式反应（PCR）扩增EMP1基因，双酶切法连接至真核表达载体pEGFP-N1双酶切产物大片段，构建pEGFP-N1-EMP1重组质粒。经测序鉴定后，通过脂质体介导法将pEGFP-N1-EMP1重组质粒和pEGFP-N1空载体转染至人舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞，荧光显微镜下观察转染后绿色荧光蛋白的表达情况，实时荧光定量PCR法检测转染后24、48、72 h的EMP1过表达水平。利用Transwell迁移及侵袭实验分析EMP1过表达对Tb3.1细胞迁移及侵袭能力的影响。结果成功克隆EMP1全长基因，经测序分析证实将EMP1基因准确插入真核表达载体pEGFP-N1，转染后细胞可见绿色荧光表达。实时荧光定量PCR结果显示，pEGFP-N1-EMP1重组质粒转染24 h组，Tb3.1细胞中EMP1表达量显著高于pEGFP-N1空载体组、野生型细胞组以及重组质粒转染48 h和72 h组。Transwell迁移及侵袭实验结果显示，EMP1过表达抑制了Tb3.1细胞的迁移和侵袭能力。结论成功构建了EMP1真核表达载体，并在体外证实了EMP1过表达可抑制舌鳞状细胞癌细胞的迁移和侵袭能力，为进一步研究EMP1基因在口腔鳞状细胞癌转移中的作用及其分子机制奠定了基础。

上皮膜蛋白1；舌鳞状细胞癌细胞；载体；转染；细胞迁移；细胞侵袭

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤，近几十年，虽然外科手术及放射等治疗手段得到不断发展，但OSCC患者5年生存率却未能得以显著提高，肿瘤区域性和远处转移是导致治疗失败的主要原因之一［1］。由于舌的淋巴和血运丰富，舌鳞状细胞癌更易发生转移，患者术后发生颈淋巴结转移者大约54%，而隐匿性颈转移率也可达42%［2］。临床常用的肿瘤辅助检查方法，如超声、CT、MRI和正电子发射计算机断层扫描（positron emission computed tomography，PET）等对这些隐匿性颈转移，微小转移灶等均不敏感；因此，确立有效的舌鳞状细胞癌转移分子标志物，对隐匿性及微小转移灶的早发现、早治疗及判断预后和提高生存率等具有重要意义。上皮膜蛋白1（epithelial membrane protein 1，EMP1），又称肿瘤相关性膜蛋白（tumor-associated membrane protein，TMP）、进展相关性膜蛋白（progression association protein，PAP）、CL-20和B4B，染色体定位于12p12.3，是由157个氨基酸组成的含4个跨膜结构的糖蛋白，参与细胞的增殖、分化，与肿瘤的发生和发展密切相关［3］。已有研究［4-7］证明，EMP1对多种肿瘤细胞，如喉癌、胃癌及结肠直肠癌等细胞的增殖、迁移和侵袭等具有抑制作用，但对个别肿瘤细胞，如非小细胞肺癌的增殖则起着促进作用。EMP1对舌鳞状细胞癌细胞迁移、侵袭等生物学行为的影响尚少见报导。本研究旨在构建EMP1基因真核表达载体，转染舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞系，检测EMP1对舌鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭能力的影响，为进一步深入研究EMP1在OSCC转移中的作用机制奠定基础。

1　材料和方法

1.1主要试剂和仪器

真核表达载体pEGFP-N1质粒（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、胶回收试剂盒、DL2000、DL10000、SYBR Premix Ex TaqⅡ［宝生物工程（大连）有限公司］，DH5α感受态、无内毒素质粒提取试剂盒（北京博迈德基因技术有限公司），总蛋白提取试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。T4连接酶（Promega公司，美国），鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司），鼠抗绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合蛋白单克隆抗体（南京恩晶生物科技有限公司），Lipofectamine 2000脂质体（Invitrogen公司，美国）。舌鳞状细胞癌Tb3.1及P160细胞（天津市肿瘤医院惠赠）。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）基因扩增仪（Perkin-Elmer公司，美国）；DYY-Ⅲ 31B水平电泳仪（北京六一仪器厂）；超微量分光光度计（北京凯奥科技发展有限公司）；凝胶成像系统（Ultra-Violet Products公司，美国）；小型垂直电泳槽和转膜槽及配套电源（Bio-Rad公司，美国）；实时荧光定量PCR仪（Roche Diagnostics GmbH公司，德国）；荧光显微镜（Zeiss公司，德国）。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成从GenBank中检索人EMP1核心编码区cDNA序列，再用DNASIS 2.5计算机软件辅助设计人EMP1序列上游引物和下游引物，在上下游引物中分别引入限制性内切酶XhoⅠ和Hind Ⅲ位点（下划线处为酶切位点）:上游引物为5'-GCGCCTCGAGATGTTGGTATTGCTGGCTGGTAT-3'，下游引物为5'-GCGCAAGCTTTTTCTTTCTCAGGACCAGATAG-3'。用于实时荧光定量PCR的EMP1引物为:上游引物5'-CCCTCCTGGTCTTCGTGT-3'；下游引物5'-GGAATAGCCGTGGTGATA-3'。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2.2EMP1基因克隆扩增P160细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基在37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境下培养。当P160细胞生长至约90%融合时，进行总RNA提取，具体操作步骤遵照RNA提取试剂盒说明书进行。电泳定量后，取1 μg总RNA，根据逆转录试剂盒说明书混合逆转录反应体系，进行逆转录。以获取的cDNA为模板扩增EMP1基因，PCR反应体系总体积50 μL，含模板4 μL，上、下游引物各3 μL，dNTP 1 μL，10×PCR buffer 5 μL，Taq酶0.4 μL，ddH2O 33.6 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40个循环；72 ℃ 延伸5 min。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒进行纯化回收PCR产物。

1.2.3表达载体的构建克隆扩增的EMP1进行XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化回收目的片段。pEGFP-N1质粒经相同酶切处理，分离纯化回收大片段。根据T4连接酶说明书，将纯化回收的EMP1 DNA和pEGFP-N1大片段按照质量比1∶10的比例用T4连接酶，室温下连接3 h。连接产物转化感受态DH5α后，涂布于卡那霉素抗性的LB软琼脂平板，37 ℃过夜培养，挑选琼脂糖平板上单克隆菌落，进行PCR鉴定和酶切鉴定后测序。

1.2.4细胞转染测序正确后，采用无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化pEGFP-N1-EMP1重组质粒及pEGFP-N1质粒，测定浓度。转染前24 h将Tb3.1细胞铺被于6孔板，待细胞贴壁融合达80%～90%时，按Lipofectamine 2000脂质体说明书进行转染，每孔脂质体5 μL、质粒2.5 μg，荧光显微镜下观察转染24、48及72 h后，细胞中GFP表达情况。

1.2.5实时荧光定量PCR检测转染后细胞EMP1 mRNA的表达分别于转染后24、48、72 h，采用试剂盒法提取转染细胞RNA，测定含量和纯度，按逆转录试剂盒说明书合成cDNA模板，使用实时荧光定量PCR法检测转染不同时间点细胞EMP1 mRNA的表达水平。每个样本设3个重复孔，内参选择β-actin，基因相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。反应体系总体积20 μL，含模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL，ddH2O 6.4 μL。反应条件:95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。

1.2.6Transwell法检测细胞侵袭和迁移能力侵袭实验中，首先采用预冷无血清RPMI1640培养基稀释Matrigel基质胶，铺被于Transwell上室内，置于37 ℃孵箱中4～5 h。于转染后24 h收集细胞，用无血清培养基调整细胞密度至1×106个·mL-1，取100 μL接种于含Matrigel基质胶的Transwell小室上室内，下室加入含20%血清的RPMI1640培养基，继续培养24 h。将上室内细胞轻轻拭去，用PBS洗两次，再行多聚甲醛固定，结晶紫染色后显微镜下观察，随机选5个视野，计数穿膜细胞，以每个视野的平均细胞数表示舌鳞状细胞癌细胞的侵袭能力。迁移实验时Transwell小室内不铺被Matrigel基质胶，其余同侵袭实验。

1.3统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，对实时荧光定量PCR和Transwell迁移及侵袭实验结果行单因素方差分析和多重比较检验，检验水准为双侧α=0.05。

2　结果

2.1EMP1基因的扩增与重组pEGFP-N1-EMP1表达载体的构建

以P160细胞cDNA为模板，PCR扩增EMP1基因，经琼脂糖凝胶电泳分离后，在约490 bp处可见特异性扩增条带，与目的基因相对分子质量相符（图1）。扩增产物回收纯化后连接至T载体，进行转化筛选，选取鉴定和测序均正确的菌落进行扩增。提取质粒，经XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切获取EMP1基因，与同样经双酶切的表达载体pEGFP-N1大片段连接，成功构建pEGFP-N1-EMP1表达载体。

图1　PCR扩增EMP1基因琼脂糖凝胶电泳Fig　1　Agarose gel electrophoresis of EMP1 gene by PCR

2.2pEGFP-N1-EMP1表达载体的鉴定

扩增转化DH5α后在软琼脂平板上筛选出单克隆菌落共7个，以其为模板分别进行EMP1 PCR扩增鉴定，其中5个单克隆菌落电泳后可见约490 bp的特异性条带。对其中一株PCR阳性克隆进行质粒提取，经XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，电泳亦可见一条约490 bp条带，与目的基因相符（图2）。经测序鉴定，克隆的人EMP1基因序列与GenBank中已知基因序列完全一致，无突变碱基。

2.3转染细胞EMP1 mRNA水平的表达

经脂质体介导，将pEGFP-N1质粒和pEGFP-N1-EMP1重组质粒瞬时转染至Tb3.1细胞，转染后细胞内可见绿色荧光（图3），表明pEGFP-N1-EMP1重组质粒和pEGFP-N1质粒在Tb3.1细胞中表达GFP。实时荧光定量PCR检测结果（图4）显示，pEGFP-N1-EMP1重组质粒转染后，Tb3.1细胞中EMP1表达增强，转染24 h后，Tb3.1细胞EMP1相对表达量明显高于其他各组（P＜0.05），是pEGFP-N1质粒转染组（空载体组）的103.7倍，是野生型细胞组的196.1倍；pEGFP-N1质粒转染组和未转染的野生型Tb3.1细胞中，EMP1表达量较低，二者间EMP1表达的差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2　pEGFP-N1-EMP1表达载体的鉴定Fig　2　Identification of recombinant expression vector pEGFP-N1-EMP1

图3　pEGFP-N1和pEGFP-N1-EMP1质粒转染Tb3.1细胞48 h后GFP的表达　荧光显微镜　× 100Fig　3　GFP expression in the Tb3.1 cells transfected with pEGFPN1 and pEGFP-N1-EMP1 after 48 hours　fluorescence microscope　× 100

2.4EMP1对舌鳞状细胞癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响

迁移和侵袭实验检测结果如图5、6所示，pEGFPN1-EMP1重组质粒转染组迁移及侵袭的Tb3.1细胞数均明显低于pEGFP-N1质粒转染组和野生型Tb3.1细胞组（P＜0.05），pEGFP-N1质粒转染组和野生型Tb3.1细胞组间迁移及侵袭细胞数差异无统计学意义（P＞0.05），表明EMP1可抑制舌鳞状细胞癌细胞的体外迁移和侵袭能力。

图4　实时荧光定量PCR检测Tb3.1细胞EMP1 mRNA表达Fig　4　The expression of EMP1 mRNA in Tb3.1 cells by real-time fluorescence quantitative PCR

图5　EMP1抑制Tb3.1细胞迁移及侵袭Fig　5　EMP1 inhibited the migration and invasion of Tb3.1 cells

图6　Tb3.1细胞迁移和侵袭实验形态学观察　荧光显微镜　× 100Fig　6　Morphological observation of the migration and invasion of Tb3.1 cells　fluorescence microscope　× 100

3　讨论

肿瘤转移是多基因参与且涉及多环节的复杂过程。癌细胞从原发肿瘤位置侵袭到周围组织，是导致肿瘤转移发生的第一步，癌细胞的黏附、运动、迁移和侵袭能力是发生转移的条件。EMP1基因与外周髓鞘蛋白-22（peripheral myelin protein 22，PMP-22）同属一个跨膜家族，细胞外结构域序列保守，具有一致的N-糖基化序列。这个糖基化位点携带修饰过的含有人自然杀伤细胞抗原-1（human natural killer-1，HNK-1）决定簇的糖链，可识别细胞表面糖蛋白，如一些酪脂类、蛋白聚糖等碳水化合物结构，这些蛋白参与细胞黏附，细胞间以及细胞和外界基质间的相互作用，说明EMP1与细胞黏附过程有关，在细胞生长、增殖、分化及凋亡中起着重要作用［3，8-10］。

正常组织中，EMP1在舌和食管等鳞状上皮中表达丰度较高。体外培养的支气管上皮细胞鳞状上皮转化过程中EMP1表达升高，较之轻中度增生或无化生上皮，严重增生或伴有化生的上皮组织中EMP1 mRNA水平较低，提示EMP1高表达与鳞状上皮分化密切相关［3，8，11］。研究［4-7，12-14］显示，在胃癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌等肿瘤组织中EMP1蛋白相对表达量较正常组织显著下降，且其表达水平与肿瘤侵袭、淋巴结转移、临床分期和组织学分级有相关性，EMP1表达越低，患者的5年生存率越差，而EMP1过表达可抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。Sun等［12］研究表明，在EMP1过表达的乳腺癌MCF-7细胞中，Caspase-9增高，血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）蛋白表达降低，提示EMP1可能是通过调节Caspase-9 和VEGFC蛋白表达对乳腺癌进行负性调节。但是，在非小细胞肺癌和神经胶质瘤发生过程中，则伴有EMP1表达显著上调。另有研究［7，15］显示，EMP1过表达可促进肺腺癌PC9细胞增殖和无胸腺裸鼠体内PC9成瘤的生长，同时伴有磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路激活，推测EMP1表达可能是通过激活PI3K/AKT通路促进非小细胞肺癌的形成和发展。另外，EMP1还与非小细胞肺癌、胃肠道间质瘤及非白血性白血病等耐药有关，被认为是吉非替尼耐药的生物标志物，产生耐药的机制则可能涉及EMP1与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路的相互交联作用［7，16］。基因表达谱分析表明，OSCC中EMP1表达明显下调。免疫组织化学分析显示，EMP1表达与OSCC患者淋巴结转移和临床分期存在一定的相关性，但EMP1在OSCC转移过程中具体作用机制尚不明确［17］。

本研究采用实时荧光定量PCR方法获得人EMP1基因全长，将其克隆扩增后，连接至真核表达载体pEGFP-N1，成功构建了EMP1真核表达载体。利用脂质体法将pEGFP-N1-EMP1瞬时转染至舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞。真核表达载体pEGFP-N1具有猿猴病毒40（simian virus 40，SV40）启动子和巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）启动子，可使目的基因在增殖细胞中稳定表达；同时携带有新霉素抗药基因，可用G418筛选稳定转染的细胞株，利于后续进行EMP1稳定过表达舌鳞状细胞癌细胞株的筛选。Tb3.1细胞系是人舌鳞状细胞癌细胞脑转移株，不仅具有舌鳞状细胞癌细胞所有的特性，而且更易增殖和转移［18］。本研究通过荧光显微镜观察和实时荧光定量PCR检测EMP1瞬时转染后EMP1表达情况，选择EMP1表达较高的时间点进行了Transwell迁移和侵袭实验，结果发现，EMP1过表达有效抑制了转移性较强的Tb3.1细胞的迁移和侵袭能力。

总之，本研究成功构建了EMP1真核表达载体pEGFP-N1-EMP1，并在体外证明，EMP1基因过表达可有效抑制舌鳞状细胞癌Tb3.1细胞的迁移和侵袭能力，为进一步探究EMP1在OSCC转移中的具体作用及其分子机制奠定了基础。

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（本文编辑吴爱华）

Construction of epithelial membrane protein 1 eukaryotic expression vector and its influence on migration and invasion of human oral tongue squamous carcinoma cells

Dai Xiaohua1， Zhang Jun2， Zou Huiru1， Lian Xiaoli1， Li Yanni1， Wang Guanhua1， Yan Yan1. （1. Research Center， Tianjin Stomatological Hospital， Stomatological Hospital of Nankai University，Tianjin 300041， China； 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Tianjin Stomatological Hospital， Stomatological Hospital of Nankai University， Tianjin 300041， China）
Supported by: Tianjin Health and Family Planning Commision Foundation （2013KZ053）. Correspondence: Zhang Jun， E-mail: zjsurgeon@126.com.

ObjectiveThis study aimed to construct a eukaryotic expression vector pEGFP-N1-EMP1 of epithelial membrane protein 1 （EMP1） and investigate its influence on migration and invasion of human oral tongue squamous carcinoma cells. MethodsThe human EMP1 gene was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction and then ligated into the pEGFP-N1 vector by double restriction endonuclease digestion to construct pEGFP-N1-EMP1 recombinant plasmid. After sequencing identification， pEGFP-N1-EMP1 recombinant plasmid and pEGFP-N1 plasmid were transfected into human oral tongue squamous carcinoma Tb3.1 cell line. The expression of green fluorescent protein in cells was observed after transfection using an inverted fluorescence microscope. The overexpression of EMP1 mRNA was identified at 24， 48， and 72 h after transfection by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction. The effect of EMP1 overexpression on migration and invasion of Tb3.1 cells was detected by Transwell assay. ResultsThe full-length EMP1 gene sequence was successfully obtained. Sequence analysis showed that the EMP1 gene was inserted into the pEGFP-N1 vector correctly. Green fluorescence was observed in the transfected cells under fluorescence microscopy. The results of real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction indicated that the expression of EMP1 at 24 h after pEGFP-N1-EMP1 transfection was significantly higher than the other groups. Transwell assays indicated that overexpression of the EMP1 gene could significantly inhibit the migration and invasion ability of Tb3.1 cells. ConclusionThe eukaryotic expression vector of EMP1 was successfully constructed， and EMP1 overexpression was confirmed to inhibit the migration and invasion of oral tongue squamous carcinoma cells in vitro. This study laid a foundation for further investigation on the influence of the EMP1 gene on the metastasis of oral tongue squamous carcinoma and its molecular mechanism.

epithelial membrane protein 1；oral tongue squamous carcinoma cell；vector；transfection；cell migration；cell invasion

R 73

A

10.7518/hxkq.2016.04.016

2015-11-10；

2016-02-20

天津市卫计委基金（2013KZ053）

代晓华，副研究员，硕士，Email:jstonehome@163.com

张军，副主任医师，博士，Email:zjsurgeon@126.com