温肾活血化湿方对肾间质纤维化大鼠肾组织NF-κB表达的影响*

李建省，靳 锋，王宝蕊甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050



温肾活血化湿方对肾间质纤维化大鼠肾组织NF-κB表达的影响*

李建省，靳 锋，王宝蕊
甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

目的：探讨温肾活血化湿方对单侧输尿管梗阻（uni l at eral uret eral obst ruct i on，U U O）法致肾间质纤维化大鼠肾组织核转录因子-κB（N F-κB）表达的影响，初步揭示该方防治肾间质纤维化的作用机制。方法：采用U U O建立大鼠肾间质纤维化模型，将雄性SD大鼠80只随机分为假手术组、U U O组、氯沙坦组和温肾活血化湿方组，每组20只；于造模后第2天开始灌胃，假手术组、U U O组给予等量生理盐水，氯沙坦组灌胃氯沙坦［10 m g/（kg·d）］，温肾活血化湿方组灌温肾活血化湿方汤剂［9.8 m g/（kg·d）］。于造模后第7、14、21天留取梗阻侧肾组织行H E、M asson染色，观察肾组织病理变化，免疫组化法检测肾组织N F-κB的表达。结果：第7、14、21天U U O组中N F-κB表达较假手术组高（P＜0.05），治疗组在第7天较U U O组低（P＜0.05）。结论：温肾活血化湿方可能通过抑制N F-κB的过度表达从而延缓肾间质纤维化的进程。

肾间质纤维化；肾组织核转录因子；温肾活血化湿方；大鼠

WenShen HuoXue HuaShi prescription；the rats

肾间质纤维化(RIF)是各种慢性肾脏病进展至慢性肾衰竭的主要原因之一。慢性肾功能衰竭发病率高、治疗困难，RIF在肾脏疾病转归中起主导作用，其病变程度与慢性肾脏病的预后密切相关。寻求其早期可逆因子或防治措施对肾脏疾病转归具有重要意义，是目前医学界研究的热点。目前抗RIF的治疗多采用抗RAS系统药物、抗氧化剂、免疫抑制剂、他汀类药、活性维生素D、吡非尼酮等干预，但效果不甚理想。中医药工作者从中医病因、病机、治法方面进行研究，并从单味中药、有效成分及中药复方防治RIF方面进行了大量临床及实验研究，效果满意。在前期的临床研究中发现温肾活血化湿方具有改善肾功能，降低尿蛋白，延缓慢性肾功能衰竭的功效。本研究利用UUO法复制肾间质纤维化大鼠模型，观察温肾活血化湿方对肾组织结构及N F-κB表达的影响，初步探讨其防治肾间质纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型复制 将清洁级3～4周龄SD雄性大鼠120只［体质量100～140 g，兰州大学医学院动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(甘)2009-0004］随机分为4组：假手术组、UUO组、温肾活血化湿方组、氯沙坦组，每组30只。参照文献［1］采用单侧输尿管结扎手术(UUO 法)建立肾间质纤维化大鼠模型。其余各组以5%水合氯醛3.5 m L/kg腹腔注射麻醉，从右侧旁正中切口剪开腹壁，暴露右侧输尿管，结扎右侧输尿管，关闭腹腔。假手术组只分离但不结扎输尿管。术后第2天给药，假手术组、UUO组给予等量生理盐水，氯沙坦组灌胃给予氯沙坦［10 m g/(kg·d)］混悬液，温肾活血化湿方组给予温肾活血化湿方(由黄芪、川芎、续断、牛膝、菟丝子、桂枝、白豆蔻等组成，以上药物经我院制剂室经水煮提取，含生药2 g/m L，按换算系数换算成大鼠灌胃给药)水煎液［9.8 m g/(kg·d)］。术后第7、14、21天分别平均处死每组大鼠10只，切除右肾，甲醛固定、脱水后包埋备用。

1.2 肾组织病理检测 取右侧肾组织切片，进行苏木素-伊红(H E)、M asson染色，在光镜下观察肾脏组织形态结构变化情况

1.3 免疫组织化学法检测N F-κB表达情况 按照两步法免疫组化检测试剂盒(H RP-多聚体抗兔，武汉博士德生物公司提供)操作步骤，PBS代替一抗作为阴性对照，DAB显色，苏木素轻度复染，光镜下观察肾组织N F-κB的表达。光镜下细胞核、细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性信号。采用Im age-Pro Pl us 6.0图像分析软件半定量分析免疫组化图片。根据累计吸光度与面积的比值，选取10个不重叠视野，进行统计分析。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以(±s)表示，组间多重比较采用SN K-q检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 肾组织病理学改变 H E、M asson染色观察：假手术组肾小管排列整齐，无萎缩，肾脏病理改变不明显。UUO组可见肾间质水肿，上皮细胞肿胀，炎性细胞浸润，肾小管扩张，伴有肾小管萎缩；2治疗组肾小管病变程度较UUO组减小。

2.2 免疫组化染色结果 假手术组肾小管上皮细胞、肾间质细胞胞浆阳性染色较弱；UUO组与假手术组比较，胞核中阳性染色强。UUO组随着时间的延长，肾小管上皮细胞、肾间质细胞胞浆阳性染色减少。UUO组在术后第7、14、21天阳性染色面积均明显高于假手术组(P＜0.05)。2治疗组在术后7天阳性染色面积较UUO组减少(P＜0.05)，术后21天时UUO组与氯沙坦组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肾小管间质N F-κB表达的相对吸光度值比较(±s)

表1 各组大鼠肾小管间质N F-κB表达的相对吸光度值比较(±s)

注：★表示与假手术组比较，P＜0.05；△表示与U U O组比较，P＜0.05；●表示与氯沙坦组比较，P＜0.05。

组别 只数 7 d 14 d 21 d假手术组 30 0.42±0.21 0.39±0.18 0.41±0.20 U U O组 30 2.93±0.72★●1.65±1.41★1.32±0.58★●氯沙坦组 30 0.87±0.36△0.77±0.39 0.35±0.13△温肾活血化湿方组 30 0.55±0.30△0.54±0.24 0.64±0.45

3 讨论

目前，肾间质纤维化动物模型有单侧输尿管梗阻(unil ateralureteralobstructi on，UUO)动物模型、环孢素A肾病动物模型、5/6肾切除(subtotalnephrectom y，STN x)模型等。UUO模型是研究肾小管间质纤维化公认的模型。输尿管结扎导致肾间质纤维化，引起肾脏弥漫性损害［2-3］。

N F-κB是一种介导细胞内信号转导的重要转录因子，具有多向性调节作用，调控一系列重要的免疫因子表达，参与肾组织损害及肾纤维化形成过程［2-3］。当受到外界信号的刺激时，N F-κB由静止状态存在于胞浆中的非活性形式迅速活化，并移到胞核中参与基因的转录调控及一系列重要的免疫因子表达，参与肾组织损害过程［4-6］。

肾间质纤维化属中医学“关格”“溺毒”“水肿”“虚损”等范畴。刘玉宁认为“虚、痰(浊)、瘀、毒”是导致肾间质纤维化发生、发展的关键；樊均明以“肾痿”立论；王献耀教授提出“肾络微型癥瘕”是肾纤维化的中医病机。《素问·生气通天论篇》说：“阳气者若天与日，失其所，则折寿而不彰。”《类经附翼》说：“天之大宝，只此一丸红日，人之大宝，只此一息阳气。”“肾为五脏之本”，阳气的盛衰对机体正常的生理活动至关重要。肾中阳气衰亏，则五脏六腑皆失所恃，而阴阳病变无所不至，故温阳法为其治疗大法［7］。笔者认为虚、瘀、痰湿是导致慢性肾脏病肾间质纤维化发生、发展的关键。肾虚为本，痰(浊)、瘀为标，毒是加重肾间质纤维化不可忽视的方面。因此，温肾活血化湿法治疗慢性肾脏病临床效果满意。

目前，国内外研究证实TGF-β1/Sm ad信号转导通路、EM T与肾间质纤维化密切相关。在前期研究中发现，温肾活血方治疗慢性肾脏病肾间质纤维化具有较好的临床疗效，并且发现温肾活血方能够降低UUO大鼠细胞外基质，肾阳虚肾络瘀阻为肾间质纤维化主要病机，温肾活血化湿方具有温肾活血、健脾化湿之功效。已有研究证实［8］，黄芪、川芎能调节细胞免疫及体液免疫，降低尿蛋白，保护肾功能，或通过下调TGF-β和α-SM A表达，或抑制肾小管转分化、下降ECM的主要成分、下调TGF-β、CTGF表达等多途径多靶点抑制肾小管上皮细胞增殖，抑制肾小管上皮细胞转分化，改善肾间质纤维化。中药补肾益气法能抑制成纤维细胞过度活化，促进其凋亡［9］。补肾活血法及其中药可以加速细胞外基质降解，减少细胞外基质积聚，防治肾小球硬化［10］。益气活血方通过下调TGF-β、sm ad 2和上调sm ad 7的表达来抑制CTGF表达，进而遏制肾纤维化的进展［11］。

本研究结果表明温肾活血化湿方具有良好的抗肾纤维化作用，通过减少TGF-β1的表达和减少N F-κB蛋白的活化，使细胞外基质合成及沉积减少，减轻肾间质纤维化，为温肾活血化湿方进一步研究提供实验依据。

［1］ Y ang J，Li u Y.Bl ockage of t ubul ar epi t hel i al t o m yofi brobl astt ransi t i on by hepat ocyt e grow t h fact or prevent s renali nt erst i t i alfi brosi s［J］.JA m Soc N ephrol，2002，13（1）：96-107.

［2］ 赵宗江，仇琪.核转录因子κB在肾间质纤维化中的作用［J］.中国中西医结合肾病杂志，2006，7（10）：610-612.

［3］ Subash C G upt a，Chi t ra Sundaram，Si m one Reut er，et al.Inhi bi t i ng N F-κB act i vat i on by sm al lm ol ecul es as a t herapeut i c st rat egy［J］.Bi ochi mBi ophys A ct a，2010，1799（10-12）：775-787.

［4］ 水华，陈德基，徐联芳.单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的机制［J］.武汉大学学报：医学版，2001，22（4）：328-330.

［5］ Sanz A B，Sanchez-N i no M D，Ram os A M，etal.N F-kappa B i n renali nfl am m at i on［J］.Journaloft he A m eri can Soci et y of N ephrol ogy，2010，21：1254-1262.

［6］ 刘尚建，孙卫卫，崔谨，等.和解聚散方对U U O模型大鼠肾组织N F-κB表达的影响［J］.中国中西医结合肾病杂志，2013，14（1）：62-63.

［7］ 武士锋，赵菁莉，杨洪涛.杨洪涛教授运用附子温阳治疗慢性肾脏病的经验［J］.中国中西医结合肾病杂志，2009，10（11）：945-947.

［8］ 张瑞芳，万建新，许艳芳.中药抗肾小管上皮细胞间充质转分化的研究进展［J］.中国中西医结合肾病杂志，2011，12（4）：368-371.

［9］ 沈烨渠，何立群.补肾益气法防治肾间质纤维化机制研究概况［J］.中医杂志，2010，51（5）：468-470.

［10］王丽敏，张勉之，张艳秋.补肾活血法对肾小球系膜细胞M M P-2 及TIM P-2表达的影响［J］.广东医学，2010，31（9）：1092-1094.

［11］刘咏梅，刘瑞华，刘文军，等.益气活血方对肾间质纤维化大鼠肾脏TG F-β/sm ad信号通路及结缔组织生长因子的影响［J］.中西医结合学报，2010，8（12）：1165-1173.

Influence of WenShen HuoXue HuaShi Prescription on the Expressions of NF-κB in Renal Tissue of the Rats with Renal Interstitial Fibrosis

LI Jianshen，JIN Feng，WANG Baorui
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China

Objective：To reveal the mechanism of WenShen HuoXue HuaShi prescription in preventing and treating renal interstitial fibrosis initially by exploring its influence on the expressions of nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue of unilateral ureteral obstruction（UUO）induced rat model with renal interstitial fibrosis.Methods：Rat model with renal interstitial fibrosis was established by UUO method，eighty rats were separated into sham operation group，UUO group，losartan group and WenShen HuoXue HuaShi prescription group，20 rats each group；they began to lavage from the second day after successfully establishing the models，the rats in the sham operation group and UUO group accepted intragastric administration of physiological saline in the same amounts，losartan group losartan ［10 mg/（kg·d）］，WenShen HuoXue HuaShi prescription group WenShen HuoXue HuaShi decoction［9.8 mg/（kg·d）］.In the seventh，14th and 21st day after successful establishing the models，renal tissue from the obstructed kidney were taken out and dyed by HE and Masson，to observe pathological changes of renal tissue，the expressions of NF-κB were detected in renal tissue by immunohistochemical method.Results：The expressions of NF-κB in UUO group were higher than these of sham operation group in the seventh，14th and 21st day （P＜0.05），the treatment group was lower than UUO group in the expressions of NF-κB at the seventh day（P＜0.05）.Conclusion：WenShen HuoXue HuaShi prescription could delay the progression of renal interstitial fibrosis by inhibiting over expressions of NF-κB possibly.

renal interstitial fibrosis；nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue；

李建省（1976—），男，博士学位，副主任医师。研究方向：慢性肾脏疾病的中医药防治。

R975.5

A

1004-6852（2016）01-0019-03

2015-02-27

甘肃省自然科学基金项目（编号1308RJZA 164）；甘肃省高等学校科研项目（编号2013A-082）。