一株产红色素的丝枝蜡蚧霉新菌株

董　旋，曾桂萍，陈万浩，韩燕峰，梁宗琦

(贵州大学 生命科学学院真菌资源研究所，贵州 贵阳 550025)



一株产红色素的丝枝蜡蚧霉新菌株

董旋，曾桂萍，陈万浩，韩燕峰*，梁宗琦

(贵州大学 生命科学学院真菌资源研究所，贵州 贵阳 550025)

为了对我国西部地区土壤中稀有且重要的真菌资源进行调查，采用经典形态学及分子系统学方法相结合，对获得的菌株进行鉴定。从西藏采集的样品中分离获得一株蜡蚧霉GZUIFR.SP477菌株，其主要特征是：菌落白色，背面鲜红色；分生孢子梗上仅2-3个瓶梗着生，大多数瓶梗直接着生于菌丝上，单生、对生至轮生；瓶梗椭圆形至柱状，(5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm；分生孢子卵圆至长椭圆形，(2.5-6.0)μm×(1.8-2.2)μm，呈短链。基于形态学及分子系统学方法相结合鉴定，蜡蚧霉GZUIFR.SP477菌株为我国一新记录种，丝枝蜡蚧霉LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams。

无性型真菌；丝状真菌；分类鉴定

蜡蚧霉属LecanicilliumW. Gams & Zare 隶属于子囊菌门(Ascomycota)，肉座菌目(Hypocreales)，虫草菌科(Cordycipitaceae)。基于rDNA ITS、大亚基及小亚基的序列分析，以Lecanicilliumlecanii(Zimm.) Zare & W. Gams为模式种，Zare & Gams[1]将轮枝孢属VerticilliumNess 中那些分生孢子排列呈单叠瓦状或常形成粘孢团的虫生种移入了新属蜡蚧霉属，有性型为Torrubiella和Cordyceps。目前，该属包含24个种(http://www.indexfungorum.

org/Names/Names.asp)，其主要属征为：分生孢子梗通常着生于气生菌丝上，其上着生一至几个瓶梗轮生体；瓶梗比较离散，向上突然变为很细的颈部；分生孢子大多单生，粘结成头状或成链，大多椭圆形。大多数种属于虫生真菌或真菌寄生菌。国内对该属的分类研究报道较少，仅见有名录，未进行详细分类描述及鉴定。如谢占玲等[2]对青海湖耐盐真菌调查时曾分离到L.aphanocladii，苘娜娜等[3]从浙江省蚕区的病蚕或病蛹中也曾分离到L.attenuatum，L.saksenae和L.aphanocladii。

由于广泛用于食品、化妆品、和医药中的很多人工合成的着色剂具有严重的安全问题，从天然资源发展色素的生产已引起全球的关注。目前已授权天然食品着色剂多是来源于植物和动物，但它们有不少缺点，如对光、热、或不利的pH值不稳定，水溶性低，褪色快。从真菌中寻找天然色素倍受人们关注。已知能获得高产色素的真菌多属于红曲，青霉，拟青霉Paecilomycessenulato和虫草Cordycepssenulato属中的一些种[4-5]。

近年，作者在西藏地区做土壤真菌资源调查时，新分离到一种在人工培养基上能产生鲜明红色素的蜡蚧霉属菌株Lecanicilliumsp.。本文将对该菌株进行描述、图解及分子系统学分析。

1　材料与方法

1.1菌株的分离

参照韩燕峰等[6-7]从土壤中分离真菌的方法进行。菌株GZUIFR-SP477分离自西藏自治区拉孜县的一麦田土样。

1.2菌种的形态学描述

形态学参照Zare R & Gams W.[1]文献进行。采用常规查氏培养基和PDA培养基[6]在40℃下恒温培养7 d，观察记载菌落特征并用显微镜对菌株的微观产孢结构进行测量和拍照，然后进行形态学鉴定。

1.3DNA提取及PCR扩增

参照韩燕峰等[4]的操作方法，采用DNA提取试剂盒提取总DNA，用通用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGTGAGAGATTTCTGTGC-3′)对ITS1-5.8S-ITS2 rDNA进行PCR扩增。扩增体系选用25 μL反应体系，包括引物ITS4 1 μL，ITS5 1 μL，2×Master Mix 12.5 μL，模板2 μL，无菌水补足25 μL。PCR条件为：94℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。将获得的PCR产物交北京诺赛公司进行测序，得到的序列经校正后提交(GenBank KX021371)。

1.4数据处理和系统发育树的构建

从GenBank中下载蜡蚧霉属种的序列共48条，所用的序列信息如菌名、菌株号和登录号见图2，以Simplicilliumlanosoniveum(J.F.H. Beyma) Zare & W. Gams的ITS1-5.8S-ITS2 rDNA序列为外群，用ClustalX 1.83进行序列比对，手工校正后，用Mrbayes 3.1.2，经1 000次Bootstrap验证，构建系统发育树[8]。

2　结果与分析

2.1形态描述

丝枝蜡蚧霉(图1)

LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams，NovaHedwigia. 73(1-2): 27 (2001)

=AcremoniumaranearumPetch，Trans.Br.mycol.Soc. 16(4): 242 (1932) (1931)

PDA培养基上，25℃，14 d，菌落直径大约41 mm，绒毛状，白色，背面鲜红色；菌丝宽1.2-1.5 μm，有隔；分生孢子梗直立，原瓶梗(prophialid)少，仅2-3个瓶梗着生其上，大多数瓶梗直接着生于菌丝上，单生、对生至轮生。瓶梗椭圆形至柱状，(5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm；分生孢子长卵圆至椭圆形，(4.5-6.0)μm×(1.8-2.2)μm，呈短链。

研究菌株：GZUIFR.SP477，现保存于贵州大学真菌资源研究所(GZAC)。

产地：西藏，拉孜，麦田土样。

图1　蜡蚧丝枝霉GZUIFR.SP477菌株

2.2分子鉴定

采用Mrbayes法构建的系统发育树显示(图2)，所用的蜡蚧霉属各种的不同菌株能很好的区分。L.kalimantanense与L.wallacei以97%的支持率聚为一支；L.fungicola以99%的支持率聚为一亚支；L.aranearum菌株以96%的支持率聚为一支；L.primulinum以92%的支持率聚在一起；L.psalliotae以83%的支持率聚为一亚支；5株L.attenuatum、3株L.lecanii和2株L.muscarium都能各自聚为一亚支；L.sabanense、L.longisporium与L.nodulosum以84%的支持率聚为一亚支；四株聚为一亚支的L.saksenae与L.aphanocladii以96%的支持率聚为一分支；其中菌株GZUIFR.SP477与丝枝蜡蚧霉L.aphanocladii以97%，并与其余蜡蚧霉种明显区分。

3　结论与讨论

目前蜡蚧霉属报道的有效种有26种，菌株GZUIFR.SP477的形态描述在菌落颜色、分生孢子梗和孢子形态等方面与R.Zare & W.Gams[1]的描述基本一致(表 1)。

图2　基于ITS-5.8S rDNA序列，采用Mrbayes法构建的蜡蚧霉属菌株的系统发育关系

Fig.2Relationships inferred fromMrbayes analysis ofLecanicilliumspecies based on ITS-5.8S rDNA sequences. Numbers above branches indicate posterior probabilities in Bayesian analyses after 10，000，000 generations.Simplicilliumlanosoniveumwas used as outgroup

表1　菌株GZUIFR.SP477与蜡蚧丝枝霉形态特征比较

基于ITS-5.8S rDNA序列，采用Mrbayes 法对菌株GZUIFR.SP477与Lecanicillium中其余种构建的系统发育树表明，该属为单源发生，这与R.Zare & W.Gams[1]采用ITS、大亚基及小亚基共3个rDNA基因序列获得的系统发育结果一致，说明ITS-5.8S rDNA序列可以作为该属分种的依据。同时经综合形态特征和分子系统学分析，菌株GZUIFR.SP477应鉴定为丝枝蜡蚧霉LecanicilliumaphanocladiiZare & W. Gams。

真菌能形成化学稳定性高、化学结构及色调多样的色素，例如能合成和分泌各种醌类、酸类、酮类以及一些含氮化合物色素[9]。目前，已获得高产色素的主要真菌类群有红曲霉、青霉、拟青霉和虫草[10]中的一些种。其中，一些不产毒素的青霉，如产紫青霉(P.purpurogenumFleroff)等研究报道较多[11-12]。Gunasekaran & Poorniammal[4]报道了一个产蒽醌类红色素的青霉新菌株。此菌产生的色素可用于食品和化妆品，通过优化培养条件，红色素的产量提高了7倍。现本文报道一株产红色素的新菌株，以期为天然红色素在食品和化妆品等领域的应用提供新资源。

[1]Zare R，Gams W. A revision ofVerticilliumsect.ProstrataIV. The genusLecanicilliumandSimplicilliumgen.nov.[J].NovaHedwigia，2001(73): 1-50.

[2]谢占玲，王欢，赵朋，等. 分离自青海湖可培养耐盐真菌的多样性研究[J].菌物学报，2012，31(2): 187-195.

[3]苘娜娜，马焕燕，鲁华云，等. 不同分子类型家蚕病原性白僵菌的分离及致病性试验[J].中国蚕叶，2015，36(3): 32-37.

[4]GUNASEKARAN S，POORNIAMMAL R. Optimization of fermentation conditions for red pigment production fromPenicilliumsp. under submerged cultivation[J].AfricanJournalofBiotechnology，2008，7 (12): 1894-1898.

[5]MAPARI AS，THRANE U，MEYER AS. Fungal polyketideazaphilone pigments as future natural food colorants? [J].TrendsinBiotechnology， 2010，28(6): 300-307.

[6]HAN YF，WANG YR，LIANG JD，etal. A new species of the genusChrysosporiumfrom the farmland soil of Qinghai Province[J].Mycosystema，2013，32(4): 606-611.

[7]韩燕峰，王玉荣，梁建东，等. 来自青海农田土壤的金孢属一新种[J].菌物学报，2013，32(4): 606-611.

[8]CHIRIVI-SALOMON JS，DANIES G，RESTREPO S，etal.Lecanicilliumsabanensesp. nov. (Cordycipitaceae) a new fungal entomopathogen of coccids [J].Phytotaxa，2015，234(1):63-74.

[9]PASTRE RMA，RODRIGUES-FILHO E，SOUZA AQL，etal. Diversity of polyketides produced byPenicilliumspecies isolated from Media azedarach and Murrayapaniculata [J].QuimNova，2007，30(8): 1867-1871.

[10]韩燕峰，梁建东，梁宗琦，等. 培养基成份对双梭孢虫草色素形成的影响[J].贵州农业科学，2011，39(11): 95-98.

[11]张馨，曹红，李春，等. 产紫青霉菌的发酵条件及色素稳定性、安全性的研究[J].中国食品添加剂，2016，68(2): 68-74.

[12]刘维，阮璐雅，管成林，等. 一株铁皮石斛内生真菌H1B1产红色素稳定性的研究[J].中国食品添加剂，2016，68(1)71-75.

A new fungus strain (producing red pigment) ofLecanicilliumaphanocladii

DONGXuan,ZENGGui-Ping,CHENWan-Hao,HANYan-Feng*,LIANGZong-Qi

(InstituteofFungusResources,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

The objectives of the study were to investigate and discover some rare and important fungi from the soil in the western China. Fungus strains were isolated and identified by the classical morphological characters and molecular systematics. Strain GZUIFR.SP477 from Xizang autonomous region was discovered. The main characteristics of this strain were as follows: colony white, dorsal surface obviously bright red; only 2-4 phialides produced from the conidiophore, most phialides directly from the mycelium, solitary, opposite and in whorls, ellipsoid to cylindrical, (5.5-10)μm×(1.5-1.8)μm; conidia oval to long ellipsoid, (2.5-6.0) μm×1.8-2.2 μm, sometimes on short chains. It is concluded that strain GZUIFR.SP477, based on the morphological characters and molecular systematics, is a new strain, which produces red pigment, of Lecanicillium aphanocladii Zare & W. Gams, a new record for the species in China.

Anamorphic fungi, Filamentous fungi, Taxonomy and identification,Lecanicilliumaphanocladii

1008-0457(2016)03-0091-04国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.03.018

2016-04-07；修回日期：2016-05-17

科技部基础专项项目子项目“金孢及近似4属志的研编”(No. 2013FY110400)；国家自然科学基金项目“广义拟青霉属的系统发育及支序的分类地位研究”(No. 31460010)；贵州省优秀青年科技人才培养对象专项资金项目“中国西南地区戴氏霉属真菌资源系统学及其对秸秆降解利用的前期研究”(No. 2013-05)。

韩燕峰(1978-)，博士，教授，主要研究方向：真菌资源系统发育及其利用价值研究；E-mail：swallow1128@126.com。

Q939.9

A