疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠基因表达谱的影响

刘琪，翟春涛，王建国，马彦平，元海军，杨琬芳，凌莎莎，智鹏，冯振宇

（1.山西中医学院，山西太原030024；2.山西省中西医结合医院，山西太原030013）

疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠基因表达谱的影响

刘琪1，翟春涛1，王建国2，马彦平1，元海军1，杨琬芳1，凌莎莎1，智鹏1，冯振宇2

（1.山西中医学院，山西太原030024；2.山西省中西医结合医院，山西太原030013）

目的：采用基因表达谱芯片技术筛选疏风宣肺解毒方治疗流感病毒感染小鼠相关的差异表达基因，初步探讨方药治疗流感的作用机制。方法：流感病毒肺适应株FM1滴鼻感染小鼠，建立小鼠流感病毒性肺炎模型，方药灌胃治疗4 d，提取肺组织总RNA，与小鼠全基因表达谱芯片杂交后进行检测。对筛选得到的药物治疗过程中的差异表达基因进行生物信息学分析。结果：基因芯片结果显示，与模型组相比，给药组表达量发生变化的基因中上调的有2 659条，下调的有2 216条。结论：疏风宣肺解毒方作用涉及免疫学方面的分子功能为：胞内信号级联放大效应，浆膜、免疫应答、细胞增生的调节，免疫防御及细胞程序性死亡等；主要调节的代谢途径有：丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、肿瘤信号通路、toll样受体信号通路、信号转导及转录激活因子途径、自然杀伤细胞介导的细胞毒作用及趋化因子信号通路等。

基因芯片；疏风宣肺解毒方；流感病毒

基因芯片技术是建立在基因探针、杂交测序技术上的一种快速高效的核酸序列分析方法，在分子生物学、人类基因学前瞻性研究中起着革命性的重大意义。基因芯片高密度的显微排阵，大批量地筛选基因和巨大的功能信息处理等特点，为研究十分复杂的生命现象及疾病等提供了一个先进方法［1-2］。疏风宣肺解毒方是山西省名老中医、山西省实验方剂学带头人王世民教授根据山西省的自然条件拟定的方药。通过基因芯片实验检测疏风宣肺解毒方对流感病毒性肺炎小鼠基因表达谱的影响，将为进一步研究方药的作用靶点提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 流感病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1由本实验室-75℃冰箱保存。复苏后，于9日龄鸡胚尿囊腔连续传代3次后，测定血凝滴度为28。

1.1.2 实验动物体质量14~15 g的SPF雄性ICR小鼠，合格证号为0194691；小鼠及饲料均由北京斯贝福实验动物科技有限公司提供；实验动物洁净柜中饲养，环境保持室温（26±2）℃，相对湿度（50±10）%。

1.1.3 药物疏风宣肺解毒方由菊花、桑叶、杏仁、桔梗、连翘、柴胡等组成，颗粒剂，山西省中西医结合医院药房制备。阳性对照药物为达菲（磷酸奥司他韦胶囊），75mg。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与造模ICR小鼠40只，随机分为4组，正常组（N）、模型组（M）、达菲对照组（C）、疏风宣肺解毒方组（S），每组10只。将各组小鼠用乙醚轻度麻醉，正常组以0.05mL生理盐水滴鼻，其余各组以0.05 mL的4LD50流感病毒FM1稀释液滴鼻感染小鼠。感染后2 h灌胃给药。N、M组灌服蒸馏水，C组灌服达菲2.5 g/mL/d。按照人与小鼠体表面积换算出给药剂量。S组灌服疏风宣肺解毒方药。1次/d，0.2mL/次，连续给药4 d。第5天禁食不禁水8 h，摘眼球放血致死，无菌摘取全肺，存于液氮中冻存，用于提取总RNA。

1.2.2 样本RNA提取与纯化取各组样本约100 mg，液氮中快速研磨，加入1mL Trizol，移至预冷的EP管。4℃，12 000 rpm，离心15min，移出上清液，加入0.2mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置2min。12 000 rpm，离心15min，收集上清，加入等体积的异丙醇，室温放置20min。4℃，15 000 rpm，离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75% RNase-free乙醇洗涤。4℃，7 500 rpm，离心5min。弃上清液，干燥3min。再加入50μL RNase-free水溶解RNA。获取各组样本总RNA，经紫外分光光度仪测定OD值，甲醛变性凝胶电泳检测［3］。

1.2.3 芯片检测采用晶芯小鼠27K全基因组表达谱芯片分别测定4组差异基因的表达情况，均进行3次技术重复。应用cRNA扩增试剂盒将总RNA样品放大，反转录生成cDNA，将荧光标记的样本加入杂交液，进行基因芯片杂交检测［4-5］。将芯片上的水分清除后，将芯片置于黑色的盒中保存。

1.2.4 数据处理扫描杂交芯片，计算探针讯号在各组与M组的强度比值，I为讯号强度。筛选差异表达基因的标准为：上调基因要求P值＜0.05，且log2比值＞1，下调基因要求P值＜0.05且log2比值＜-1。本研究利用NCBI数据库、KEGG基因组信息数据库等，对差异基因进行GO功能富集分析和代谢途径富集分析。

1.3 统计学方法

实验结果采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，显著性比较选用单因素方差分析法，两组间比较应用LSD多重分析法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA提取

四组样本提取总RNA的Ratio比值OD260/ OD280≥1.8，电泳检查有清晰的RNA条带，28 S和18 S比值在2/1以上，证明提取的RNA保持了良好的完整性，无降解，符合基因芯片的质量检测要求。

电泳图中清晰地显示28S及18S核醣体RNA的片段，可直观显示RNA样品提取的质量（见图1）。如果样品总RNA在提取过程中严重降解，则电泳图上不会呈现清楚的两个片段。

2.2 差异基因聚类分析

四组样本经基因芯片技术扩增后，得到差异基因的聚类分析图，每组都包括三个技术重复。经软件分析，S组与M组相比，共得到了数千条差异基因，包括上调的和下调的。如表1所示。

图1 样本RNA提取电泳图

表1 各组差异基因数目

2.3 差异基因GO功能富集分析

对疏风宣肺解毒方样本组的差异基因进行GO term节点富集分析，选取GO节点要求符合P＜0.05并且涉及的基因数不小于70。方药治疗组涉及到GO分子功能节点的有许多方面，包括生物、代谢、信号转导通路等。我们选取了疏风宣肺解毒方调节的与免疫学相关的主要的分子功能，从表2中可以看出，包括：GO：0007242～intracellular signaling cascade（胞内信号级联放大效应）、GO：0005886～plasmamembrane（浆膜）、GO：0006955～immune response（免疫应答）、GO：0042127～regulation of cell proliferation（细胞增生）、GO：0006952～defense response（免疫防御作用）及GO：0042981～regulation of apoptosis（细胞程序性死亡）等。另外，GO：0043167～ion binding（离子结合作用）、GO：0000166～nucleotide binding（核苷酸结合作用）等方面的分子功能作用显著，为方药作用机制的进一步研究提供了依据，也为多个学科的交叉研究指明了方向。

表2 疏风宣肺解毒方药组差异基因的分子功能富集

2.4 差异基因的代谢途径富集分析

在KEGG数据库中，对疏风宣肺解毒方组的差异基因调节的代谢通路进一步分析，要求P＜0.01并且涉及的基因数不小于3，筛选处的差异基因主要调节的代谢途径有：MAPK signaling pathway（丝裂原活化蛋白激酶信号通路）、Cytokine-cytokine receptor interaction（细胞因子与细胞因子受体的相互作用）、Pathways in cancer（肿瘤信号通路）、Toll-like receptor signaling pathway（Toll样受体信号通路）、Jak-STAT signaling pathway（信号转导及转录激活因子途径）、Natural killer cellmediated cytotoxicity（自然杀伤细胞介导的细胞毒作用）及Chemokine signaling pathway（趋化因子信号通路）等。差异基因的代谢途径富集分析过程显示P值较小，差异显著，富集程度较高，结论比较可靠。

3 讨论

将具有相似表达谱的样品聚集成一类，也可以理解为检测同一类样本之间的重复性。本实验样品各组能聚到一类，说明同一类样本间的重复性较好［6］。

实验四组样本中涉及到的所有基因组进行基因本体论分析，表明分子功能方面涉及到基因组包括跨膜信号转导机制、受体激动机制等。细胞组分方面涉及到细胞核、细胞质膜等。生物学过程方面涉及到氧化应激、免疫反应、蛋白质转录等环节。然后，分别对疏风宣肺解毒方与模型组比较的差异基因从GO term和pathway两个角度进行深入分析［7］。

疏风宣肺解毒方对流感病毒感染小鼠的基因表达谱具有显著的影响。对方药组的差异基因进行GO term节点富集分析，按照P＜10-4，且涉及的基因数分别为不小于70取GO节点，对疏风宣肺方涉及免疫学方面的分子功能为：胞内信号级联放大效应、浆膜、免疫应答、细胞增生的调节、免疫防御及细胞程序性死亡等。在KEGG数据库中，对差异基因涉及的代谢通路进行进一步分析。代谢途径P值较小，差异显著，富集程度较高。从代谢路分析结果可知，其主要通过调节丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞因子与细胞因子受体的相互作用、toll样受体信号通路、信号转导及转录、趋化因子信号通路等达到治疗流感的作用。课题组将重点对与流感有关的相关信号通路的差异基因进一步分析。

［1］刘娇.应用基因芯片技术研究心血管活性药物导致心肌损伤的机理［D］.武汉：华中科技大学，2011.

［2］军事医学科学院.军事医学科学院生物芯片研究进展［J］.中国科学，2011，41（10）：790-795.

［3］Huihui Chen，Hui Sun，Fuping You，etc.Activation of STAT6 by STING is critical for antiviral innate immunity［J］.Cell，2011，147：436-446.

［4］季旭明，程明，王世军，等.大黄及其含药血清指纹图谱比较分析［J］.山东中医药大学学报，2012，36（1）：69-71.

［5］Ying Yang，Xiaogang Shu，Dan Liu，etc.EPAC Nullmutation impairs learning and social interactions via aberrant regulation of miR-124 and Zif268 Translation［J］.Neuron，2012，73（2）：774-788.

［6］李昊，杨慧萍，鲁小青.应用基因芯片研究藤梨根对胃癌细胞的作用［J］.同济大学学报（医学版），2010，31（1）：45-52.

［7］Ji Hae Lee，Boram Cho，Hee-jin Jun，etc.Momilactione B inhibits protein kinase A signaling and reduces tyrosinase-related proteins 1 and 2 expression inmelanocytes［J］.Biotechnol Lett，2012，10（12）：529-537.

（编辑：张世霞）

Effects of Shufeng Xuanfei Jiedu formula on whole genome expression profiles of pneumonia m ice infected w ith influenza virus

Liu Qi1，Zhai Chuntao1，Wang Jianguo2，Ma Yanping1，Yuan Haijun1，YangWanfang1，Ling Shasha1，Zhi Peng1，Feng Zhenyu2
（1.Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan Shanxi 030024；2.Shanxi Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine，Taiyuan Shanxi030013）

Objective：To study the effects of Shufeng Xuanfei Jiedu Formula on whole expression profiles ofmice infected with influenza virus FM1by the gene chip technology，and analyze themechanism of the formula on gene level.Methods：Established the model of Pneumonia by nasal dropping influenza virus A in mice.Total RNA was extracted in each groups.Then gene chipswere used to screen these RNA samples.Calculated the probe signal intensity ratio in each group vs model group.Results：By Shufeng Xuanfei Jiedu formula group compared with themodel group，2 659 genes were upregulated，2 216 geneswere down-regulated.Conclusion：Themechanism of Shufeng Xuanfei Jiedu formula involves the immunology molecular function：intracellular signaling cascade，plasma membrane，immune response，regulation of cell proliferation，defense response，regulation of apoptosis，etc.The metabolic pathways regulated by Shufeng Xuefei Jiedu formula involve：MAPK signaling pathway，Cytokine-cytokine receptor interaction，pathways in cancer，Toll-like receptor signaling pathway，Jak-STATsignaling pathway，Naturalkiller cellmediated cytotoxicity，chemokine signaling pathway，etc.

gene chips；Shufeng Xuanfei Jiedu formula；influenza virus

R285

A

1671-0258（2016）06-0008-03

山西省基础研究项目青年科技研究基金（2015021192）；山西省卫生和计划生育委员会科研项目基金（2014098）

刘琪，讲师，博士，E-mail：angel200644@126.com

马彦平，教授，E-mail：sxtcm_wm@126.com