超低温冷冻同种异体骨与骨制备的骨组织库建立及临床应用*

龚旭 潘剑成贺立新 聂利 杨文超 蒋华生 梁健铭

论著·经验交流

超低温冷冻同种异体骨与骨制备的骨组织库建立及临床应用*

龚旭 潘剑成*贺立新 聂利 杨文超 蒋华生 梁健铭

目的建立现代骨组织库，观察系列冷冻干燥同种骨移植的临床效果。方法采用深低温冷冻法、真空冷冻干燥和辐照灭菌法进行保存，临床应用异体骨时，根据患者的需要和骨组织库的记录资料合理选择，运用于骨缺损填充、脊柱和关节融合手术89例。结果 术后随访6～24月，89例未见明显排斥反应，疗效满意。结论 冷冻干燥同种异体骨制备的松皮质填充骨、颈腰椎融合器等系列使用安全，保存和运输方便，用于修复骨缺损及脊柱融合等，是一种有效的方法。

骨组织库；冷冻干燥法；同种异体骨；骨移植；临床应用

临床中脊柱病变需融合或因损伤、疾病引起骨缺损，尤其是脊柱椎间隙融合及其大块骨缺损者靠病人自身修复相当困难，这就需要植骨来进行融合及填补骨缺损。骨组织库的建立能提供替代自体骨的移植材料，因此骨组织库已成为现代骨科的必备设施。自2012年7月始，本院骨组织库在实验研究和传统同种骨移植技术的基础上，同上级医院合作，参考国内外的先进方法，建立了以深度低温、真空冷冻干燥、真空包装和辐照灭菌为核心技术的现代骨组织库，2013年1月开始将同种异体骨颈腰椎融合器、同种异体填充骨临床应用于骨缺损、脊柱和关节融合手术89例，现将系列冷冻干燥同种异体骨的制备及应用报告如下：

1 材料与方法

1.1 冻干同种异体骨制备相关

1.1.1 骨来源获取及其储存方法

骨材料来自合法取得的捐献供体，无菌手术切除的骨组织及创伤截肢后的骨骼，如股骨颈骨折患者被置换下来的股骨头、椎管后路减压术切除的椎板和棘突、开胸术切下来的肋骨、开颅减压术切下来的颅骨及关节置换取下的髌骨、能够提供较多骨量的有外伤性截肢无污染的肢体骨；死亡4～8小时以内的捐献供体。在无菌条件下取骨，供体血清学检验指标按国内献血要求：HIV、HbsAg、HCV和梅毒血清反应阴性；年龄男性＜55岁，女性＜50岁；尸体骨取材时间常温下不超过8小时，4℃以下不超过24小时，骨组织取材时建立供体记录及组织获取登记表，连同供体血清检验化验单长期保存，并建立供体与临床应用一体的电子档案以备随访。

1.1.2 深度冷冻

骨材料以3层无菌单包裹，注明供体编号和日期，随即放入-80℃冰箱内保存1个月以上即可应用，低温冷冻可以降低骨的抗原性，储存时间越长，抗原性越低。储骨前及植骨前须作细菌培养，如无细菌生长方可储存或作为植骨材料。

1.1.3 真空冷冻干燥及其型号加工

骨材料切成各种规格后经清除软组织，清除血液和骨髓组织，物理脱脂等处理，进一步降低抗原性。为便于使用、保存和运输，需进行真空冷冻干燥处理，使含水量降到5%以内，真空100u、温度-38℃、时间3～5天，在该状态下由冰直接升华脱水。后期经静态压力及压力扭转测试等生物力学检测。

1.1.4 辐照灭菌

冻干骨经3层无菌真空包装，送解放军第三军医大进行辐照灭菌。

1.1.5 保存和运输

系列冻干同种骨植入材料在常温下可保存2年，4℃下可保存5年。

1.2 冻干同种异体骨的产品系列

松质骨条：用于各种骨缺损的填充，促进骨折愈合。关节和脊柱融合，椎体内植骨，人工关节翻修植骨等。皮松质骨条：用途同上。皮松质混合骨粒：用途同上。脊柱颈腰椎融合器：用于颈、腰椎的椎间植骨融合。髂骨块：有不同大小规格，用于胸腰椎的椎间植骨融合，后路和侧方植骨融合，四肢骨缺损的连接植骨，髋臼造盖等。

1.3 冻干同种骨的检验

一般检验包括外观、含水量、pH值及无菌检测，生物性能检验包括急性全身毒性、细胞毒性、遗传毒性、皮内刺激、过敏试验、热原试验及溶血试验等。

2 结果

自2013年1月～2015年1月，应用冷冻同种异体骨进行骨移植共89例，其中临床应用松质骨条、松皮质骨粒等填充骨，用于纤维结构不良、骨囊肿等骨缺损、髋臼翻修、脊柱骨折复位后椎体内植骨、脊柱小关节植骨等54例；颈椎同种异体骨融合器临床应用各种颈椎融合20例；腰椎同种异体骨融合器临床应用各种腰椎融合15例。患者术后无明显排异反应，切口均一期愈合，术后随访6～24月，均无异常感觉和反应，患者基本恢复正常的工作与生活，疗效满意。其中采用影像学方法和临床功能评分评价35例使用同种异体骨椎间融合器患者的融合情况和临床疗效。随访术后1～3月随访患者骨痂生长明显，椎间隙高度无明显变化，6个月至1年患者均骨性融合。

图1 男，47岁，外伤性C5/6椎间盘突出症，图a图b分别为术后随访片

图2 男，57岁，L5椎体滑脱，长期吸烟。图a图b分别为术后随访片

图3 VAS评分术后1、3、6个月末次随访均较术前改善

图4ODI评分对比图，术后1、3、6个月、末次随访均较术前改善

3 讨论

储存异体骨的方法有多种，如硫柳汞、酒精、冻干、脱钙、脱蛋白、低温冷冻等，这些方法各有优缺点。其中深低温冷冻保存异体骨，对其生物力学特性影响最小，温度越低，影响越小[1]。Parish[2]认为，骨组织在免疫中其抗原属于低度，并且骨的抗原对冷冻极为敏感，因此经过低温冷冻可使本来就不高的抗原性进一步降低，极低度的抗原性无需免疫抑制处理，骨的相容性好[3]。同时冷冻使大多数酶的活性处于静止状态，不致失活，当复温植入体内，即可以诱导骨生成[4]。-80℃低温冷冻异体骨既能保持骨组织的形态和酶的特性，还可以起杀菌作用，能长期保持骨的无菌状态，此法操作简单，能长期无菌状态下保存，应用方便，易于推广。经过深低温冷冻保存的异体骨，骨的生成诱导能力强，对骨的生物力学特性影响最小，仍保留骨较强的抗扭、抗弯强度，既能作充填物，又可起支架作用[5,6]。因此低温冷冻是目前最受欢迎的一种方法。目前，本院骨库用低温冷冻法（-80℃）只储存去除软组织的异体骨。对于部分韧带、关节软骨（后期用于重建、软骨移植）的储存方法及其应用，还在临床研究之中。

本院合作研制的同种异体骨椎间融合器应用于颈腰椎不稳定、颈腰椎滑脱和颈腰椎间盘疾病等保守治疗无效者，以其良好的成骨活性和临床效果得到了越来越多的关注，获得广泛的认可有着极佳的发展潜力。

同种异体骨椎间融合器的优点可以简单概括为[7]：融合器结构更符合正常椎间隙形态；弹性模量接近正常人体骨骼；对影像学检查影响小；可完全吸收；良好的成骨活性；成本低廉。

虽然同种异体骨椎间融合器在临床应用中表现出了良好的效果，目前仍没有充足的证据表明异体骨融合器比其他融合器有明显的优势，同时由于异体骨融合器投入使用的时间相对较短，缺乏充足的长期随访资料来判断其远期效果。同种异体骨在融合过程中的病理学变化和影像学表现都与金属或合成材料融合器不同，值得深入研究。因此，仍需要深入研究同种异体骨椎间融合器的最佳适应症和远期效果，以期为临床决策提供充足的证据。

总之，应用同种异体骨来修复骨缺损及脊柱融合等方面，是一种可行有效的好方法，随着现代骨科的发展，骨组织库将成为一项必备设备，而同种异体骨移植的应用是一种可靠材料和方法。

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[5] 李丹，胡蕴玉，袁志，等.综合骨库各类骨移植材料的制备、消毒及保存[J].第四军医大学学报，2010，22（22）:2038-2041.

[6] 杨克强，王臻，桑宏勋，等.深低温冷冻异体骨生物力学特性与储存时间的关系[J].医用生物力学，2002，15（3）:183-186.

[7] 潘剑成，龚旭，罗飞.同种异体骨椎间融合器的研究进展及临床应用现状[J].中国修复重建外科杂志，2015，29（3）:15-19.

Preparation of banking osteoarticular w ith frozen dried bone allograft and clinicalapp lication

Gong Xu,Pan Jiancheng,He Lixig,et al.Department of Orthopaedics and Arthrodesis,the 181 Hospital of PLA, Guilin Guangxi,541002,China

Objective To establish human bone tissue bank base onmodern technique and to observe the clinical result of frozen dried boneallografting.M ethods The preparativeand preservationmethod include deep refrigeration,vacuum freeze drying and radiation sterilization.Thekind of frozen dried boneallograftswereused in 89 casesofbone transplantation included bone defect,spine fusion and joint fusion base on require of patientsand recordmaterialof Tissuebank. Results The caseshad no distinguishable immunologic rejection in all89 casesw ith satisfactory results.Conclusion The frozen dried bone allograft is safety in clinicaluseand it isa perfectsubstitution of bone autograft.

Bone tissuebank;Freeze drying;Allograft;Bone transplantation;Clinicalapplication

R687.3

B

龚旭（1974-）男，博士，副主任医师。研究方向:脊柱关节。

*[通讯作者]潘剑成（1964-）男，本科，副主任医师。研究方向:脊柱外科。

2015-05-11）

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.01.011

swgk2015-05-00096

桂林市科学研究与技术开发计划（合同编号：20140120-3-3）

解放军第181中心医院脊柱骨病关节外科，广西桂林541002