明胶海绵吸附金黄色葡萄球菌法制备大鼠胫骨骨髓炎骨缺损模型*

郝健华梅兴明谢宝钢*王晓东李威扎拉嘎胡买霞陈小义

论著·实验研究

明胶海绵吸附金黄色葡萄球菌法制备大鼠胫骨骨髓炎骨缺损模型*

郝健华1梅兴明2谢宝钢1*王晓东3李威4扎拉嘎胡4买霞4陈小义4

目的 建立易复制、操作简单、试验费用低并且符合临床发病进程的大鼠骨髓炎骨缺损模型。方法 明胶海绵填充 Wistar大鼠胫骨缺损部位，注射标准金黄色葡萄球菌，骨蜡封闭骨缺损。于7、14天观察大鼠局部组织变化，CR及组织病理学检查。结果 组织病理学检查示：骨膜增生14例；结构破坏18例；中性粒细胞聚集19例；死骨形成19例；炎性肉芽组织增生19例。术后14天 CR检查，骨膜增生4例，结构破坏10例；骨干变宽9例；死骨形成14例；病理性骨折2例及骨髓炎骨缺损17例。19只大鼠术后14天软组织肿胀明显，有14例切口破溃并伴随分泌物流出，5只局部有液动感，1只大鼠术后6天死于肺部感染。结论 明胶海绵吸附金黄色葡萄球菌法能成功建立Wistar大鼠胫骨骨髓炎骨缺损模型。

大鼠；骨髓炎；骨缺损；实验性感染

建立容易复制、并能客观评判骨髓炎骨缺损临床发病进程指标是胫骨骨髓炎骨缺损建模的基础。以往应用异物和硬化剂建模[1-3]，由于异物的存在，不能很好地应用于早期加载抗生素骨修复材料预防骨组织感染方面的研究，且异物需二次取出。而硬化剂可造成部分骨组织坏死及存在对金黄色葡萄球菌毒性作用的缺陷，不符合临床骨髓炎病理变化过程，本研究探索应用亲水性和细菌吸附性较好，并能降解的明胶海绵来建模，该方面研究虽有在兔、羊等动物体内进行模型制备的报道[4]，用这些较大动物的实验，由于操作复杂、实验周期长、费用昂贵，对骨髓炎模型的研究具有一定局限性。本研究采用明胶海绵吸附金黄色葡萄球菌法制备大鼠胫骨骨髓炎骨缺损模型的研究，通过X线及病理指标客观评价骨髓炎的发病进程，以达到建立容易复制、操作简单、实验周期短及试验费用低的大鼠胫骨骨髓炎骨缺损动物模型的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级Wistar大鼠20只，由军事医学科学院实验动物中心提供 [SCXK-（军）2007-004]，雌雄不限，体重300g左右，水合氯醛（上海生工生物工程有限公司），硫化钡（上海生工生物工程有限公司），金黄色葡萄球菌标准菌株 ATCC 25923（卫生部临床检验中心提供），明胶海绵（南京金陵制药厂，规格6 cm×2 cm×0.5cm），酶标仪（ThermoMultiskan MK2型，芬兰）X线机（美国帝国设备公司产40mA，型号USIE-HFPXRU-40mA）。

1.2 方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌菌液配制

将在-80℃保存的金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC25923冻干品解冻后，取适量接种到营养肉汤管中，37℃培养16～18小时，镜检纯粹后取适量接种到两个血平板培养基上，37℃培养10小时，用加灭菌生理盐水无菌涂抹棒将菌苔取下，加到10m L营养肉汤菌体稀释液中混匀备用。

1.2.2 菌悬液吸光度的测定及细菌计数

用菌体营养稀释液将金黄色葡萄球菌混悬液稀释到适当浓度，用450nm波长酶标仪测定不同稀释度的菌液，选取吸光度在 0.30～0.80之间的稀释度菌液，此时菌液浓度在3.0×108～8.0×108CFU左右。

1.2.3 骨髓炎骨缺损模型

20只大鼠。将每只大鼠称重，实验兔用10%水合氯醛0.3m L/100mg腹腔内注射麻醉，用硫化钡脱毛，生理盐水冲洗干净后，将大鼠仰卧位固定在手术台上，碘伏消毒术区皮肤，铺无菌洞巾，在膝关节下沿胫骨前嵴内侧切开长约1.5cm皮肤切口，在胫骨前肌内侧进入达骨膜，显露胫骨上端的前外侧面胫骨嵴，在膝关节间隙下方2～4mm用3mm尖嘴咬骨钳咬除骨皮质，造成大鼠胫骨骨缺损。长度：6.0～8.0mm，宽度为2～3mm。取下皮质骨片后，生理盐水冲洗髓腔，将2mm×2mm ×6mm明胶海绵填入胫骨骨髓腔后，将0.3mL 3×106CFU的金葡菌滴注到明胶海绵内，用骨蜡封闭残损，创口分两层缝合，不包扎。术后第7、14天时，观察各项指标。

1.2.4 指标观察

创口周围软组织情况：术后第7、14天时观察创口周围软组织情况；CR检查：术后及术后7、14天行 CR检查，观察大鼠胫骨骨缺损部位的X线改变；病理学检查：术后14天取大鼠小腿组织进行组织病理学检查。

2 结果

2.1 病理检查

大鼠胫骨病变部位病理学检查发现病变附近可见散在的破骨巨细胞反应；骨膜纤维组织反应；成骨细胞增生活跃；小块死骨组织，周围可见中性粒细胞聚集及骨组织周围局部横纹肌组织萎缩伴肉芽组织增生并形成窦道，除去因感染死亡的大鼠和病理性骨折大鼠，造模成功率为85%（17/20）。术后14天大鼠病变周围病理学改变见表2、图1（彩图见插页）。

时间（d）肉芽组织增生14 19 14 18 19 19 19大鼠总数（例）病理学改变（例）骨膜增生结构破坏中性粒细胞聚集死骨形成

2.2 CR检查

术后对19只大鼠胫骨进行X线拍片检查，两例病理性骨折，17例大鼠均造成胫骨上端骨髓炎骨缺损，术后7、14天X线改变见表1、图2。

表1 实验性骨髓炎骨缺损的X光改变

图2 大鼠术后X线表现。a术后人为造成胫骨上端骨缺损；b术后7天周围软组织肿胀；c术后14天周围软组织肿胀，死骨形成

2.3 大鼠小腿软组织情况

术后7天大鼠小腿不同程度肿胀，但手术切口无破溃及分泌物流出，术后14天大鼠小腿肿胀程度加重，手术切口有14例破溃并伴随分泌物流出，5只局部有波动感，两例畸形并有异常活动。

2.4 术后大鼠生存情况观察

实验20只动物，19只建模成活，1只大鼠于术后6天死亡，病理检查提示急性肺炎改变。

3 讨论

随着加载抗生素的组织工程骨研究的进一步深入。评估其在骨髓炎及骨髓炎骨缺损治疗中的作用必须建立一种符合临床骨髓炎发病过程的动物模型。以往应用兔、狗等建立的模型，操作复杂，周期长及实验费用高并有其他因素影响，如硬化剂及异物的影响[1-3]。虽然Rissing[5]应用大鼠建立的骨髓炎模型可复性强、操作简单，一直被国内外学者应用，但是仍存在一些不足：5%鱼肝油酸钠作为血管硬化剂，可以使该局部组织产生无菌性坏死，之后逐渐被纤维结缔组织的替代；鱼肝油酸钠对金黄色葡萄球菌有毒性作用。骨组织坏死有部分是由鱼肝油造成，而不是完全由金葡球菌所致，不符合临床上骨髓炎病理变化过程。刘玉新[6]应用鱼肝油酸钠、金葡菌及异物（棉条）虽能较好复制骨髓炎骨缺损模型，由于异物的存在，不能很好地应用于早期加载抗生素骨修复材料预防骨组织感染方面的研究，且异物需二次取出。笔者应用明胶海绵填充大鼠胫骨骨髓腔后滴注金黄色葡萄球菌的方法复制骨髓炎模型。由于明胶海绵有良好的亲水性和细菌吸附性，可以为细菌提供良好的附着面，使明胶海绵能有效吸附细菌，避免细菌的丢失及充分使细菌作用于局部骨组织。并且明胶海绵具有良好的生物相容性和可吸收性，避免二次手术取出[4]。此建模能有效提高复制率、操作简单，且动物成活率高，避免鱼肝油酸钠对骨组织的破坏及对金葡菌的毒性作用，也避免异物二次手术取出及影响早期预防骨感染等的实验研究。本模型的建立通过CR及病理学检查发现病变附近可见散在的破骨巨细胞反应；骨膜纤维组织反应；成骨细胞增生活跃；小块死骨组织；周围可见中性粒细胞聚集及骨组织周围局部横纹肌组织萎缩伴肉芽组织增生，符合临床骨髓炎发病过程，并通过CR及病理检查结果能客观评价模型的准确性。不足之处在于建模过程中发生2例病理性骨折，笔者将进一步研究胫骨缺损大小、细菌浓度及饲养方法来预防早期发生骨折。

大鼠作为实验动物进行骨组织感染方面的研究，能良好地揭示骨感染的进程及抗感染物质的预防和治疗效果[7,8]。以往临床应用载药人工骨修复材料治疗骨髓炎的评估只局限于临床观察，缺乏病理学等客观评估标准[9]。在骨髓炎研究中组织病理学指标应是评估骨髓炎建模的金标准。本模型建立特点表现在：应用组织病理学检查作为评估骨髓炎的临床发病进程；揭示无创的影像学检查结果与有创的病理学检查结果的关联，为临床应用提供组织病理学依据；在实验动物的管理上，大鼠在喂养、病程观察、取材和处置上优于大中型实验动物；该模型具有可复性强、操作简单、实验周期短、费用低等优点，可作为动物模型有效评估加载抗生素骨修复材料在预防和治疗骨髓炎骨缺损的作用，也是应用大鼠建模的意义所在。所以，笔者将进一步探讨此模型在加载抗生素骨修复材料评估应用方面的研究。

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Gelatin spongeadsorbed the staphylococcusaureus to establish themodelof ratosteom yelitic bone defect

Hao Jianhua1,Mei Xingm ing2,Xie Baogang1,et al.1Department of Orthopaedics;2Department of Pathology;3 Department of Clinical Lab,the 254th Hospital of PLA,Tianjin,300142;4 Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People's Armed Police Forces,Tianjin,300309,China

Objective To establish the ratosteomyelitic bone defectmodelof easy replication,simple operation,low experimental cost and that conform to the clinical development process.M ethods Tibia deletion position was filled by gelatin sponge and then standard staphylococcusaureuswere injected into the deletion position,at lastdeletion position wasblocked by bonewax.To observe the change of local tissue and carry outCR and pathologicalexamination at the seventh day and fourteenth day.Results The exam ination ofmorbid histology showed that14 casesoccurred periosteal proliferation,18 casesoccurred disorganization,19 casesoccurred neutrophilicgranulocyteaggregation,19 casesoccurred sequestration and 19 casesoccurred inflammatory granulation tissuehyperplasia.14 daysafter thesurgery,CR exam ination showed 4 casesoccurred periosteum hyperplasia,10 casesoccurred disorganization,9 casesoccurred bone shaftbroadening,14 casesoccurred sequestration,2 casesoccurred pathologic fracture,17 casesoccurred osteomyelitic bonedefect. 19 ratsw ith obvioussofttissueswelling 14 daysafter theoperation,wherein,14 casesoccurred incision rupturew ith secretion,and 5 caseshad senseof fluid in certain areas.1 ratdied of pulmonary infection 6 daysafter theoperation.Conclusion Thismethod thatGelatin spongeadsorbed the staphylococcusaureus could establish tibialosteomyelitic bone defectmodelofWistar rats.

Rat;Osteomyelitis;Bone defect;Experimental infection

R392

A

郝健华（1983-）男，本科，医师。研究方向：骨科创伤感染及骨修复材料。

*[通讯作者]谢宝钢（1962-）男，硕士，教授，主任医师。研究方向：战创伤及骨修复材料。

2015-08-19）

10.3969/j.issn.1672-5972.2016.01.001

swgk2015-08-00158

天津市科技计划项目（NO.14ZCDZSY00033），武警后勤学院博士启动金（NO.WHB201305）

天津解放军第254医院1骨科；2病理科；3检验科，天津300142；4武警后勤学院细胞生物学与医学遗传学教研室，天津300309