丹参酮ⅡA磺酸钠联合思美泰对同种异体1/2原位肝脏移植大鼠P450及肝功能的影响

崔明华，雷尚芳，郭俐宏



丹参酮ⅡA磺酸钠联合思美泰对同种异体1/2原位肝脏移植大鼠P450及肝功能的影响

崔明华a，雷尚芳b，郭俐宏c*

十堰市太和医院(湖北医药学院附属医院)a.妇产科，b.感染科，c.针灸科，湖北 十堰 442000

[摘要]目的采用改良双袖套法建立大鼠同种异体1/2原位肝脏移植动物模型，观察术后丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞色素P450亚型酶活性及肝功能的影响，探讨药物干预机制，为临床治疗肝移植合理用药提供理论依据。方法选择60只大鼠，随机分为空白对照组、模型组、思美泰组及丹参酮组，思美泰组经尾静脉注射思美泰2 mg/(kg·d)，丹参酮组在此基础上经尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠5 mg/(kg·d)治疗14 d，空白对照组及模型组注射等体积生理盐水。采用高效液相色谱仪检测治疗前后肝微粒体细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)，生化检测肝功能中胆汁酸(TBA)、总胆红素(STB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及丙氨酸氨基转移酶(ALT)、谷氨酰转移酶(GGT)水平，并计算肝移植术大鼠存活率，评价丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠同种异体1/2原位肝脏移植的影响。结果经丹参酮ⅡA磺酸钠及思美泰药物干预，丹参酮组CYP2E1、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4酶活性及TBA、GGT、ALT、AST、STB均明显降低，存活率达60%，与模型组及思美泰组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA磺酸钠抑制大鼠肝微粒体细胞色素P450亚型酶活性，减轻过敏反应，提高同种异体1/2原位肝脏移植大鼠存活率，恢复肝功能，与思美泰联用可增强Na+/K+-ATP酶泵功能，同时，活血化淤、增加肝脏组织供氧相关。

[关键词]丹参酮ⅡA磺酸钠；同种异体1/2原位肝脏移植动物模型；肝功能；细胞色素P450亚型酶

0　引言

Lee于1973年首创大鼠原位肝移植动物模型[1]，现在多采用改良双袖套法进行肝移植术。由于肝脏移植术后随着血液再通，除机体正常的排异反应外，还多伴有肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic ischemia reperfusion，HIR)[2]。如何处理HIR，减轻排异反应，延长肝移植后大鼠的存活时间，已成为肝移植术后治疗的难题。因药物预处理及缺血预处理可减轻排斥反应，且临床效果明显优于缺血预处理方法，故在肝移植中如何采用正确的缺血预处理及药物预处理是提高术后存活时间的关键因素[3]。近年来，临床使用丹参酮ⅡA磺酸钠防治器官移植缺血再灌注损伤取得肯定的临床效果。本实验研究采用大鼠同种异体1/2原位肝脏移植动物模型，研究丹参酮ⅡA磺酸钠对肝移植术后细胞色素P450亚型酶活性及肝功能的影响，为其临床应用提供实验及理论依据。

1　材料与方法

1.1动物分组及饲养SPF级SD大鼠60只，6～8周龄，体重(180±20)g，雄性，大鼠由十堰市太和医院科研所实验动物中心提供，实验动物使用许可证：SYXK(鄂)2011-0031；实验动物生产许可证：SCXK(鄂)2011-0008。动物按随机原则分为空白对照组、模型组及丹参酮组，每组20只。应尽量在实验时减少动物使用量并落实术后动物福利：①饲养环境：动物房恒温(22 ℃，湿度50%～75%)，单笼饲养，12 h交替光照；②术后护理：伤口每日碘伏消毒1次，肌肉注射头孢克洛0.1 g/(100 g·d)预防感染，消毒护理时尽量减少动物的疼痛和不适等人道主义措施[4]；③饲养：满足实验动物伦理要求[5]，苏醒后大鼠自由饮水，普通饲料喂养，观察动物饮水进食情况，称体重，及时清理粪便。

1.2检测仪器及药品思美泰组经尾静脉注射思美泰[丁二磺酸腺苷蛋氨酸注射液，2 mg/(kg·d)]；Waters2010型高效液相色谱仪(迪马公司)；GR22GⅡ型高速冷冻离心机(美国Beck-man公司)；CAY-1型液体快速混合器(北京长安仪器厂)；SHA-C水浴恒温振荡器(江苏金坛市亿通电子有限公司)；KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；丹参酮ⅡA磺酸钠(菏泽步长制药有限公司，国药准字：Z20026866)。

1.3大鼠肝脏移植动物模型制备术前供体及受体均自由饮水，禁食，供体、受体大鼠体重应相差≤15 g。于术前20 min肌肉注射阿托品0.04 mg，手术时先剪去腹部毛发备皮，碘伏消毒，3%戊巴比妥钠0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹部向上仰卧位固定于大鼠固定器。参照文献[6]，打开腹腔(供体、受体手术应同时进行)，采用何勇等改良双袖套法中“2回折法、3结扎、4贯通”的方法，分别取供体、受体大鼠1/2肝脏进行原位交叉植入手术(目的是节约动物)，仔细吻合植入肝脏血管，分层缝合腹腔，碘伏消毒创口1周(1次/d)。空白对照组手术同上但不造模型。术后丹参酮组经尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠5 mg/(kg·d)，治疗14 d，空白对照组及模型组注射等体积生理盐水。

1.4术后观察术后护理时主要观察大鼠精神、活动及自洁情况，体毛，摄食、饮水，存活。

1.5检测指标参照文献[7]，经大鼠眶静脉取血0.5 mL置于肝素管，生化检测肝功能TBA、GGT、ALT、AST、STB。大鼠断头取肝，用GR22GⅡ型高速冷冻离心机差速离心法制备大鼠肝微粒体。先按1∶4加入匀浆缓冲液(11.5 g/L氯化钾，50 mmol/L～Tris，pH：7.4)匀浆，4 ℃下10 000 r/min离心60 min，将离心管中沉淀组织重悬于0.25 mol/L蔗糖溶液中即获得肝微粒体，分别将各组大鼠肝微粒体标本置于-80 ℃冰箱暂存，检测时用SHA-C水浴恒温振荡器37 ℃先孵育并振荡30 min，再离心20 min后取上清液，用Waters2010型高效液相色谱仪进样检测各组大鼠细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)活性。

2　结果

2.1肝移植大鼠术后观察空白对照组大鼠反应敏捷，体毛光泽，饮食正常，无动物死亡。模型组大鼠14只死亡，仅存活6只，存活率30%，蜷缩，拒绝活动，精神极差，无舔足舔毛等自洁现象，拒绝摄食、少量饮水。思美泰组11只死亡，存活9只，存活率45%，蜷缩少动，精神极差，舔足舔毛等自洁现象少，拒食、少量摄食、饮水。丹参酮组较模型组稍好，8只死亡，存活12只，存活率60%，蜷缩，活动少，精神差，有舔足舔毛等自洁现象，少量摄食、饮水。

2.2丹参酮ⅡA磺酸钠对肝功能的影响模型组、思美泰组及丹参酮组造模型后TBA、GGT、ALT、AST、STB均明显升高，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。经14 d治疗，模型组TBA、GGT、ALT、AST、STB仍然保持在较高水平，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。思美泰组和丹参酮组TBA、GGT、ALT、AST、STB明显降低，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。丹参酮组与思美泰组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　丹参酮ⅡA磺酸钠对同种异体1/2原位肝脏移植大鼠肝功能ALT、AST、STB的影响

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与思美泰组比较，*P<0.05

2.3丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞色素P450亚型酶活性的影响空白对照组治疗前后细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)活性保持正常水平；模型组及思美泰组细胞色素P450亚型酶表达均增强，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；丹参酮组CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6明显降低，与模型组及思美泰组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，CYP2C9无明显变化，与模型组及思美泰组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　丹参酮ⅡA磺酸钠对细胞色素P450亚型酶活性的影响(nmol/mL)

注：与空白对照组比较，△P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与思美泰组比较，*P<0.05

3　讨论

药物吸收后90%均经过细胞色素P450亚型酶(CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9)代谢，P450的抑制与诱导均影响药物的疗效，P450活性增强常导致药物的治疗作用降低，过敏等不良反应增高[8]。TBA、GGT、ALT、AST、STB等可客观反映肝功能，因此，我们采用P450及TBA、GGT、ALT、AST、STB等指标评定丹参酮ⅡA磺酸钠对大鼠同种异体1/2原位肝脏移植的影响。

丹参酮ⅡA磺酸钠是从红花丹参中纯化提取的酮类化学物质，未纯化前的丹参主要有效成分包括丹参酚酸、丹参酮、红花黄素、黄酮类化合物等[9]，《吴普本草》言丹参“味辛性凉、治心肌腹痛”；《药品化义》言红花“味辛性温、善通利经脉”[10]。两药合用具有“凉血消痈、调经镇痛、活血通经、散癖镇痛”的作用[11]。现代药理学证实，两药纯化提取的丹参酮ⅡA磺酸钠是产生药理效应的主要成分，具有明显的扩管及降低缺血再灌注肝微粒体P450亚型酶的作用[11]。

本研究结果显示，丹参酮组大鼠在治疗14 d时，TBA、GGT、ALT、AST、STB、CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6明显降低，存活率达60%。丹参酮ⅡA磺酸钠降低细胞色素P450亚型酶有利于药物的代谢，并且可以减少不良反应、增加疗效，与刘高峰等[12]的研究结果一致。而降低TBA、GGT、ALT、AST、STB说明其具有促进肝功能恢复的作用。CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6占P450蛋白含量的80%以上，与药物代谢及相互作用密切相关[13]。其活性升高说明药物不良反应增加，疗效降低。本实验中CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6活性降低，说明丹参酮ⅡA磺酸钠可抑制大鼠同种异体1/2原位肝脏移植术P450活性，减少不良反应，增强疗效，对缺血/再灌注肝脏具有保护作用。电生理特点分析认为，丹参可能通过增强Na+/K+-ATP酶活性,改善肝脏组织能量代谢而起到保护作用[14]。腺苷蛋氨酸是思美泰的主要成分，由机体ATP和蛋氨酸腺苷蛋氨酸环化酶作用下生成，当缺乏腺苷蛋氨酸时转甲基作用受限，质膜磷脂甲基化降低，Na+/K+-ATP酶泵功能及肝脏细胞膜流动性均下降，直接导致TBA、GGT、ALT、AST、STB升高[15]。肝移植手术创伤及异体排斥反应常造成肝功能各指标升高，丹参酮组大鼠在经丹参酮ⅡA磺酸钠+思美泰治疗后，肝功能明显降低，说明在丹参酮ⅡA磺酸钠及思美泰的共同作用下，思美泰中的腺苷蛋氨酸增强了Na+/K+-ATP酶泵功能，促进质膜磷脂甲基化。同时，丹参酮ⅡA磺酸钠起到活血化瘀，减轻血管壁炎症反应，凉血消痈的作用[16]，进而改善微循环，增加组织供氧，促进侧支循环重建及血管新生，两者共同作用促进肝功能恢复。有研究表明，丹参具有提高缺血心肌血管内皮生长因子表达，促进侧支循环血管重塑并建立有效的侧支循环及促有丝分裂原、升高肝细胞生长因子(HGF)表达的作用[17]。我们也对丹参酮ⅡA磺酸钠与血管内皮生长因子表达的相互关系进行了预实验，发现在使用丹参酮ⅡA磺酸钠后机体血管内皮生长因子的表达增强，但其促血管内皮生长因子表达增强作用的具体机制有待阐明，这将是我们下一步重点研究方向。

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收稿日期：2015-07-07

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603005

Effects of sodium tanshinone A sulfonate combined with Si Mattel on P450 and liver function in 1/2 allogenic orthotopic liver transplantation rats

CUI Ming-huaa,LEI Shang-fangb,GUO Li-hongc*

(a.Desect1ment of Obstetrics and Gynecology,b.Desect1ment of Infectious Diseases,c.Desect1ment of Acupuncture and Moxibustion,Shiyan Taihe Hospital,Affiliated Hubei Medical College,Shiyan 442000,China)

【Abstract】ObjectiveThe modified two-cuff technique was used to establish rat orthotopic liver transplantation 1/2 animal model to observe the effect of sodium tanshinone A sulfonate on the activity of liver function and P450 isoform of cytochrome P450 enzyme after operation and to explore the mechanism of drug intervention,and provide a theoretical basis for clinical rational use of drugs in treatment of liver transplantation.MethodsSixty rats were randomly divided into blank control group,model group,Si Mattel group and tanshinone group.Rats in Si Mattel group were injected with 2 mg/(kg·d) Si Mattel by tail vein;on the basis of Si Mattel group,tanshinone group was intravenously injected sodium tanshinone A sulfonate 5 mg/(kg·d) for 14 days;blank control group and model group were injected with the same volume of physiological saline.HPLC method was used to detect the liver microsomal cytochrome P450 isoforms (CYP2E1,CYP1A2,CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9) before and after treatment,biochemistry method was used to detect the level of bile acid biochemical liver function (TBA),total bilirubin (STB),assect1ate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT),gamma glutamyl transferase (GGT),and the survival rate of liver transplantation was calculated,and the effect of sodium tanshinone A sulfonate on rat allograft orthotopic liver transplantation 1/2 was calculated.ResultsThrough the drug intervention of tanshinone A sulfonic acid sodium and Si Mattel,CYP2E1,CYP1A2,CYP2C9 and CYP3A4 enzyme activity and TBA,GGT,ALT,AST and STB of tanshinone group were decreased and the survival rate increased to 60%;compared with model group and Si Mattel group,the differences were significant (P<0.05).ConclusionTanshinone A sulfonic acid sodium can improve the survival rate and restore liver function of 1/2 allograft orthotopic liver transplantation rats;the mechanism maybe related to inhibiting the activity of rat hepatic microsomal P450 isoform of cytochrome P450 enzymes,reducing the allergic reaction,reinforcing Na+/K+-ATP enzyme pump function through combination with Si Mattel,promoting blood circulation and removing blood stasis,and increasing hepatic tissue oxygen supply.

Key words：Sodium tanshinone A sulfonate; 1/2 allograft orthotopic liver transplantation animal model; Liver function; P450 isoform of cytochrome P450 enzymes