肠复康方对急性放射性肠炎大鼠小肠黏膜细胞凋亡基因的影响

李思聪，李玉明

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙　410007；2.湖南省肿瘤医院　中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南 长沙　410013)



肠复康方对急性放射性肠炎大鼠小肠黏膜细胞凋亡基因的影响

李思聪1，李玉明2

(1.湖南中医药大学，湖南 长沙410007；2.湖南省肿瘤医院中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，湖南 长沙410013)

[摘要]目的探讨肠复康方对急性放射性肠炎大鼠一般情况及小肠黏膜相关细胞凋亡基因的影响。方法以X线直线加速器给予实验大鼠全腹照射，建立急性放射性肠炎大鼠模型。将实验大鼠随机分成正常对照组，模型对照组，肠复康方低、中、高剂量组。模型复制成功后，肠复康各剂量组给予10 mL/kg灌胃，低、中、高剂量组剂量换算后分别含生药15.75、31.50、63.00 g/kg，模型对照组、正常对照组同时予等量生理盐水，连续30 d灌胃。期间观察大鼠精神状态、摄食进水、排便情况及体质量变化，处死后取相应部位的小肠用免疫组化及Western blot方法检测黏膜上皮细胞中凋亡基因Caspase-3、Bax、Bcl-2的表达。结果肠复康方干预大鼠的精神状态、饮食进水、排便情况较模型对照组改善；与模型对照组比较，肠复康方干预大鼠体质量显著增加，以中剂量组效优(P<0.05)。肠复康方低、中、高剂量组小肠黏膜的凋亡基因Caspase-3、Bax和Bax/Bcl-2表达较模型对照组显著下调、Bcl-2显著上调(P<0.05)，中剂量效优。结论肠复康方具有改善急性放射性肠炎大鼠一般情况及抑制其细胞凋亡作用，以中剂量效优，其机制可能与下调小肠黏膜上皮凋亡基因Caspase-3、Bax表达及上调Bcl-2的表达,抑制细胞凋亡有关。

[关键词]肠复康方；放射性肠炎；动物模型；细胞凋亡

放射性肠炎是盆腔、腹腔或腹膜后恶性肿瘤放疗后的主要并发症，可累及小肠、结肠、直肠，其中小肠损害为高发区，且预后较大肠预后差。目前临床上西医主要采用手术、营养支持疗法及对症处理，远期疗效并不理想。湖南省肿瘤医院中西医结合科经验方肠复康方在改善放射性肠炎临床症状上疗效满意[1-2]。既往实验研究[3-4]证实，诱导细胞凋亡是放射性肠炎形成的重要机制，其中与放射性肠炎密切相关的凋亡基因有Caspase-3、Bax、Bcl-2等。笔者通过观察低、中、高剂量组肠复康方药液对直线加速器诱导的急性放射性肠炎大鼠一般情况及小肠黏膜上皮细胞凋亡基因的影响，探讨肠复康方改善急性放射性肠炎症状的机制。

1　材料

1.1动物健康成年SPF级SD大鼠48只，6～8周龄，体质量为(220±20)g，由湖南省肿瘤医院动物实验中心提供，动物使用许可证为SYXK(湘)2014-0016。在湖南省肿瘤医院动物实验中心SPF条件下饲养，室温为20～25 ℃，相对湿度为40%～70%，持续12 h明暗交替日光灯照明，以无菌处理的标准鼠食饲养，自由活动，经过适应性喂养7 d，模型复制后继续实验性喂养30 d。

1.2药液肠复康方由金银花、连翘、白头翁、薏苡仁、谷芽各15 g，败酱草、苦参、黄柏、苍术、金钱草、车前草、仙鹤草、乌药、白术、川牛膝各10 g组成，由湖南省中医药研究院中药房提供中药饮片。参考《标准汤剂论》[5]制备肠复康方低、中、高剂量药液，分别含生药1.575、3.15、6.3 g/mL，每次制备7 d的药量，置于4 ℃冰箱中备用[6]。

1.3仪器X线直线加速器：美国Elekta Synergy；DM4000 B LED显微镜系统：德国徕卡；RM2235轮转切片机：德国徕卡；TK-212型自动恒温漂片仪：泰维科技；Varistain Gemini ES自动染色机：赛默飞世尔；TGL-18R台式冷冻离心机：深圳黑马；164-5050电泳仪：Bio-rad；DYCZ-24EN电泳槽：北京六一；DYCZ-40A转膜仪：北京六一。

1.4试剂3%戊巴比妥钠：德国merck；目测八联试纸：广州花都高尔宝；兔来源一抗Caspase-3：美国proteintech，批号为19677-1-AP；兔来源一抗Bax：美国proteintech，批号为50599-2-Ig；兔来源一抗Bcl-2：美国proteintech，批号为12789-1-AP；鼠来源一抗Actin：美国proteintech，批号为600008-1-Ig；HRP山羊抗鼠IgG：美国Proteintech。

2　方法

2.1模型复制SD大鼠适应性饲养7 d后，除正常对照组外，其余各组大鼠均禁食12～14 h，称质量，用3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉后，固定在手术板上，于长沙市中心医院放疗科以X线直线加速器给予大鼠全腹部照射(从剑突至耻骨联合)，照射面积8.5 cm×7.5 cm，源皮距100 cm，腹部给予1 cm组织补偿，照射剂量9 Gy，放射剂量率为300 cGy/min，照射时间约3 min。参照杨永滨等[6]急性放射性肠炎模型复制成功的判定标准：受照射大鼠1 d内出现吐黄水或大便性状改变，如黏液便、便血等放射性损伤症状，或用目测八联试纸检测大便呈潜血强阳性()。该实验已通过湖南省肿瘤医院动物伦理委员会评审。

2.2动物分组将大鼠随机分为5组：正常对照组8只，未经腹部照射；将模型复制成功的大鼠分成模型对照组，肠复康方低、中、高剂量组，每组10只。

2.3给药方法于判定模型复制成功后，参考李晟等[7]方法开始灌胃：灌胃容积均为10 mL/kg，肠复康方低、中、高剂量组剂量分别为15.75、31.50、63.00 g/kg，其中肠复康方低剂量为临床等效剂量；模型组、正常对照组，同时予等量生理盐水灌胃；每日1次，连续30 d。

2.4观察指标及方法

2.4.1大鼠一般情况及体质量变化每天观察模型复制成功后灌胃期间大鼠精神状态、摄食进水、排便情况变化；以电子秤称取各组大鼠体质量，7 d一次。

2.4.2免疫组化法检测大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡蛋白表达水平取大鼠回盲部近端中段回肠3 cm，沿纵轴剪开，冷生理盐水洗净，放置于盛有甲醛溶液的离心管中固定，然后移至4～6 ℃冰箱冷藏保存。取上述少量标本经甲醛固定、梯度乙醇脱水、石蜡包埋，常规切片3 μm，Caspase-3、Bax、Bcl-2分别做稀释比例为1∶200、1∶50、1∶100的免疫组化染色，再采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)法、3，3-二氨基苯联胺(diaminobenzidine，DAB)显色。具体步骤按试剂盒说明书进行。对比试剂盒阳性对照片染色，在400倍光学显微镜下随机选取10个视野观察。依据E Specht等[8]的评分标准评估肠黏膜上皮Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的免疫反应情况(染色强度和阳性细胞数量)。染色强度分为：阴性(未着色)为0分，弱阳性(浅黄色)为1分，阳性(黄色)为2分，强阳性(黄褐色)为3分；然后计算每张切片的阳性细胞百分数(≥1分的细胞数/观察细胞总数×100)。结合染色强度(0、1、2、3分)和该阳性强度的细胞百分数，计算每张切片的组织学评分(H-SCORE)。H-SCORE=[1×(%cell 1+)+2×(%cell 2+)+3×(%cell 3+)]。

2.5Western blot法检大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡蛋白表达水平取大鼠回盲部近端中段回肠3 cm，沿纵轴剪开，冷生理盐水洗净，放置于盛有甲醛溶液的离心管中固定，然后移至4～6 ℃冰箱冷藏保存。取少量标本提取小肠组织总蛋白质，经加入四甲基二乙胺(tetramethylethylenediamine，TEMED)配制的SDS-PAGE凝胶电泳后，分别切取含Bax(约21 kD)、Bcl-2(约26 kD)、Caspase-3/p17(约32 kD)和Actin(约42 kD)的凝胶，转至PVDF膜上，用三羟甲基氨基甲烷加聚山梨酯缓冲盐溶液配制5%脱脂奶粉封闭1 h后，一次孵育一抗、二抗，Bax、Bcl-2、Caspase-3和Actin的一抗稀释比例分别为1∶1 000、1∶500、1∶200、1∶4 000，二抗稀释比例为1∶3 000，ECL反应曝光、显色后用quantity one专业灰度分析软件将条带的灰度值数字化，将以Actin作内参照对比得到的相对灰度进行分析。

3　结果

3.1大鼠一般情况及体质量变化在模型复制过程中，模型组因麻醉过量死亡1只大鼠；模型复制成功后，肠复康方中剂量组因灌胃不当死亡1只。模型复制成功后，第4～7天模型组大鼠一般情况最差，大部分有黏液便或稀烂便，精神较差，甚至不进食和不饮水。第7～10天各组大鼠的精神状态、饮食和进水逐渐恢复，模型组仍有少量黏液便或稀烂便。各组大鼠的体质量变化情况见表1。以模型对照组和正常对照组为实验组合进行两因素混合设计的重复测量数据方差分析，结果显示，模型因素和时间因素对大鼠体质量的交互作用具有统计学意义(Greenhouse-Geisser校正，F(1.560,23.398)=142.95，P=0.000)；以模型对照组和肠复康方低、中、高剂量组为实验组合进行两因素混合设计的重复测量数据的方差分析，结果显示，剂量因素和时间因素对大鼠体质量的交互作用具有统计学意义(Greenhouse-Geisser校正，F(5.673，64.290)=17.64，P=0.000)。故以简单效应分析为主。模型复制后各组大鼠体质量逐渐升高，后一时点体质量均显著高于前一时点(P<0.05)，至模型复制后第29天升至最大值；自模型复制后第8天开始，模型对照组大鼠体质量均显著低于正常对照组(P<0.05)；自模型复制后第15天，肠复康方中剂量组大鼠体质量显著大于模型对照组(P<0.05)；至模型复制后第29天，肠复康方中剂量组大鼠体质量显著大于模型对照组和肠复康方低剂量组和高剂量组。

表1　各组大鼠体质量变化比较±s)

注：与模型复制后第1天比较，aP<0.05；与模型复制后第8天比较，bP<0.05；与模型复制后第15天比较，cP<0.05；与模型复制后第22天比较，dP<0.05；与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与肠复康方低剂量组比较，△P<0.05；与肠复康方中剂量组比较，◇P<0.05。

3.2各组大鼠肠黏膜上皮细胞凋亡蛋白表达水平比较(免疫组化SP法)肠黏膜上皮背景被染成淡蓝色，免疫阳性物质集中在细胞质，呈棕黄色。见图1。与正常对照组比较，模型对照组Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05)，提示小肠黏膜受放射线刺激后Caspase-3、Bax表达水平明显升高，Bcl-2表达明显降低。模型对照组和肠复康方低、中、高剂量组Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平比较，差异均有统计学意义(Caspase-3：F(3，34)=45.05，P=0.000；Bax：F(3，34)=13.06，P=0.000；Bcl-2：F(3，34)=26.21，P=0.000)，提示肠复康方对肠黏膜Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的效应具有明显的剂量依赖性。均数的多重比较发现，肠复康方中剂量对肠黏膜上皮细胞Caspase-3、Bax、Bcl-2表达水平的效应最显著。见表2和图1。

图1　各组大鼠肠黏膜上皮细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平比较(Western blot染色，10×40倍)

3.3各组黏膜上皮细胞中凋亡蛋白相对表达水平比较(Westren blot法)与正常对照组比较，模型对照组Caspase-3、Bax相对表达水平和Bax/Bcl-2显著升高(P<0.05)，Bcl-2相对表达水平显著降低(P<0.05)。模型对照组和肠复康方低、中、高剂量组Caspase-3、Bax、Bcl-2相对表达水平和Bax/Bcl-2比较，差异均具有统计学意义(Caspase-3：F(3，34)=57.84，P=0.000；Bax：F(3，34)=79.63，P=0.000；Bcl-2：F(3，34)=120.18，P=0.000；Bax/Bcl-2：F(3，34)=79.17，P=0.000)，表明肠复康方对这3种凋亡相关蛋白表达水平的效应均具有剂量依赖性。均数的多重比较显示，肠复康方中剂量升高Caspase-3、Bax和Bax/Bcl-2的效应以及降低Bcl-2的效应最明显，与模型对照组，肠复康方低、高剂量组比较，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图2和表3。

表2　各组大鼠小肠黏膜上皮Caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平比较

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与肠复康低剂量组比较，△P<0.05；与肠复康中剂量组比较，◇P<0.05。

注：1.肠复康方低剂量组；2.肠复康方中剂量组；3.肠复康方高剂量组；4.模型对照组；5.正常对照组。

图2　各组大鼠肠黏膜上皮细胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2相对表达水平比较(Western blot法)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与肠复康方低剂量组比较，△P<0.05；与肠复康方中剂量组比较，◇P<0.05。

4　讨论

放射治疗已成为盆腔、腹腔或腹膜恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，伴随患者生存情况改善所带来的肠道并发症逐年上升，由1990年的0.5%～17%上升至2007年5%～20%[9]， 65%～75%患者放疗后引起的肠道组织损伤成为制约其疗效的主要因素[10]。据研究[11]，10%～21%经过盆腹腔放疗的患者发生放射性肠炎可累及小肠、结肠、直肠。小肠的放射损伤预后较大肠差，而末端回肠因相对固定并邻近盆腔照射野，所以是小肠损害高发区[12]，且以肠黏膜基底部的隐窝细胞和黏膜上皮细胞表现最为明显[13]。

湖南省肿瘤医院中西医结合科王云启教授根据多年临床经验，认为放射性肠炎病变部位在大、小肠，与脾胃关系密切相关；致病的主因是放射线“热毒”的损伤侵犯；病机总属本虚标实、虚实夹杂，气机失调为其根本。放射性肠炎临床以湿热蕴结证型多见，治疗原则以“急则治其标”，以清利湿热调理气机为主，拟定肠复康方以清利下焦湿热、理气行滞。肠复康方由金银花、连翘、败酱草、白头翁、苦参、黄柏、苍术、薏苡仁、金钱草、车前草、仙鹤草、乌药、白术、谷芽、川牛膝等组成。其中以金银花、连翘、败酱草、白头翁为君，共奏清热解毒之功。以“治痈要药”金银花与“疮家圣药”连翘相须为用，消散肠痈；败酱草为治疗肠痈腹痛的首选，而白头翁善清胃肠湿热，两者均归大肠经，以排痈凉血、燥湿止痢。苦参、黄柏、苍术、金钱草、车前草为臣，达清利下焦湿热之效。黄柏主入下焦，清热燥湿；苦参、苍术主入脾胃，既内燥脾湿以杜生湿之源，又能外散湿邪，相合为用，洁源清流，湿热同除；金钱草、车前草共用，为利小便以实大便。薏苡仁、白术、谷芽、乌药、仙鹤草为佐。薏苡仁、白术合用以健脾运湿，加强清利湿热之功；谷芽和胃消食，乌药温通止痛，一起可防止苦寒之品败坏胃气；仙鹤草性平，味涩收敛，加强止血止痢，兼可补虚，尤适于血痢及久病泻痢。川牛膝为使药，苦善降泄，能导热下泄，引血下行。诸药合用，组方严谨、配伍合理，在经方基础上继承创新。

现代药理研究表明，金银花中多种成分均有抗菌作用，其中黄酮类物质对各类肠道致病菌有着显著的抵抗或抑制效用[14]；连翘中的连翘酯苷具有广谱抗菌、解热抗炎等作用[15]。白头翁具有抗肿瘤、增强免疫功能、抗炎、抗病原微生物及治疗内毒素血症等作用[16-17]。白术可以调节胃肠运动，还能抗溃疡、增强免疫力[18]430。败酱草不但具有抑菌抗炎等作用，还可以镇静、镇痛[18]124。另外苦参、黄柏、苍术、仙鹤草也均有抗炎抑菌的作用，仙鹤草还可以通过改善微循环，减轻黏膜炎症，加速黏膜修复[20]。

各种肠炎从病理学上区分，放射性肠炎主要为黏膜下间质水肿、局部出血和明显质深染的炎性细胞浸润，溃疡性结肠炎主要为炎症性改变及黏膜下隐窝脓肿形成，克罗恩病主要为裂隙样溃疡和结节病样肉芽肿，缺血性肠炎可见含铁巨噬细胞[20]。但都是由于肠黏膜受损而出现肠道症状，如腹痛、腹泻、便血，故临床辨证为湿热蕴结于肠道，均可予肠复康方加减。

Caspase是参与细胞凋亡执行的指挥中枢之一，学界普遍认同Caspase-3是参与细胞凋亡执行的最重要的蛋白酶，是哺乳动物细胞凋亡的关键酶[21]，有着“死亡蛋白酶”之称。Song S等[22]研究认为急性放射性肠炎的发生与Fas通路有关， FasⅡ型细胞(如肝细胞)通过线粒体膜电势的消失，线粒体膜通透性增高，释放细胞色素c促进形成凋亡体，然后召集并激活Caspase-3，进而引发Caspases级联反应[23]，通过线粒体膜通道开放、通透性转换导致细胞凋亡已被证实[24-25]。本实验中经肠复康方干预后，大鼠小肠黏膜中Caspase-3降低，进一步验证了肠复康方能够抑制急性放射性肠炎的细胞凋亡。

Bcl-2家族是目前凋亡分子机制研究的热门靶分子，在凋亡的调控中，Bcl-2和Bax可相互作用，形成一个复杂的调控网络，正常情况下Bax、Bcl-2的表达量处于相对的稳态，当Bax占优势时细胞发生凋亡，当Bcl-2占优势时细胞免遭凋亡，Bax/Bcl-2比值改变决定细胞凋亡的发生，是凋亡调控的一个重要因素[26]。袁翠堂[27]研究证实放射性损伤后患者黏膜细胞凋亡增强与Bcl-2的参与有密切关系。本实验中经肠复康方干预后大鼠小肠黏膜中Bax降低、Bcl-2升高，使得Bax/Bcl-2降低，说明肠复康方能够下调急性放射性肠炎的细胞凋亡水平。

本实验依据韩磊等[28]用不同剂量全腹照射后大鼠的肠黏膜损伤情况，选用9.0 Gy复制符合临床急性放射性肠炎肠黏膜屏障损伤的急性放射性肠炎动物模型，成功率为97.5%，其中有1只大鼠因模型复制过程中麻醉过量而死亡。本实验结果显示，肠复康方干预急性放射性肠炎可以改善大鼠的黏液便或稀烂便、精神状态、饮食进水、体质量变化等一般情况，其机制可能与下调促凋亡基因Caspase-3和Bax的表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。其中以肠复康方中剂量组效果较优，这种作用与药物的剂量有关，剂量过低时疗效一般，达到中剂量时疗效增强，但再增加剂量疗效又随之降低。肠复康方低剂量为临床等效剂量，低、中、高剂量比例为1∶2∶4，高剂量组大鼠的一般情况及体质量变化不如中剂量组，参考文献[29]，考虑与剂量过高、浓度过高、大鼠肠道吸收达到饱和、使药物不能充分发挥作用有关，但具体机制尚不明确，有待进一步研究。

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基金项目：湖南省中医药管理局一般课题(201177)

作者简介：李思聪(1991-)，女，硕士研究生

通信作者：李玉明，liyuming@hnszlyy.com

[中图分类号]R516.1[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.04.019

(收稿日期：2016-02-19；编辑：曹健)

Effect of Changfukang Prescription on Apoptotic Genes in Small Intestinal Mucosa in Rats with Acute Radiation Enteritis

LISi-cong1,LIYu-ming2

(1.HunanUniversityofChineseMedicine,HunanChangsha410007,China；2.HunanCancerHospital&TheAffiliatedTumorHospital,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,HunanChangsha410013,China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Changfukang prescription on general condition and apoptotic genes in the small intestinal mucosa in rats with acute radiation enteritis. MethodsAn X-ray linear accelerator was used to perform total abdominal irradiation for experimental rats to establish the rat model of acute radiation enteritis. The experimental rats were randomly divided into normal control group, model control group, and low-, medium-, and high-dose Changfukang groups. After the model was successfully established, all rats in the low-, medium-, and high-dose Changfukang groups were given 10 mL/kg Changfukang decoction by gavage, equivalent to doses of the crude drug of 15.75 g/kg, 31.50 g/kg, and 63.00 g/kg, respectively, as was determined by dose conversion. The rats in the model control group and the normal control group were given normal saline of the same volume by gavage. All the rats were treated by gavage for 30 days continuously. The mental state, food and water intake, defecation, and change in body weight were observed. After the rats were sacrificed, the corresponding small intestinal tissues were harvested, and immunohistochemistry and Western blot were used to measure the expression of apoptotic genes Caspase-3, Bax, and Bcl-2 in small intestinal epithelial cells. ResultsCompared with the model control group, the Changfukang groups showed significant improvements in the mental state, food and water intake, and defecation, as well as significant increases in body weight, and the medium-dose Changfukang group showed the best response (P<0.05). Compared with the model control group, the low-, medium-, and high-dose Changfukang groups showed significantly downregulated expression of Caspase-3 and Bax, a significant decrease in Bax/Bcl-2 ratio, and significantly upregulated expression of Bcl-2 (P<0.05), and the medium-dose Changfukang group showed the best response.ConclusionChangfukang prescription can improve the general condition of rats with acute radiation enteritis and inhibit cell apoptosis, and the medium-dose Changfukang decoction has the best effect. Its mechanism may be related to downregulation of the expression of apoptotic genes Caspase-3 and Bax, upregulation of the expression of Bcl-2, and inhibition of cell apoptosis in small intestinal epithelial cells.

[Key words]Changfukang prescription;Radiation enteritis;Animal model; Cell apoptosis