黑莓鲈一种致病菌的发现及分离鉴定

时少坤，冯卫权，邓国华，彭景书（广东省深圳市渔业服务与水产技术推广总站，广东 深圳 518067）

黑莓鲈一种致病菌的发现及分离鉴定

时少坤，冯卫权，邓国华，彭景书
（广东省深圳市渔业服务与水产技术推广总站，广东 深圳 518067）

从濒死的黑莓鲈（Pomoxisnigromac ufastus）病灶内，分离纯化一株优势菌B017，用生理生化、细菌/药敏分析仪、16S rRNA基因序列分析等方法对其进行鉴定，采用回归感染的方法对其致病性检验；同时进行药敏感性试验。结果表明，该致病菌为类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigeloide）；AHM试验、运动力试验、氧化酶试验、吲哚试验均为阳性，革兰氏阴性菌，能发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖类。该菌对头孢曲松、头孢噻吩、头孢唑林等头孢类药物敏感，对卡那霉素、万古霉素和哌拉西林等耐药，对黑莓鲈的半致死量为2.6×104cfu/g。

黑莓鲈；类志贺邻单胞菌；分离；鉴定

黑莓鲈，也称美国银斑、银斑鱼，属日鲈科，莓鲈属，是一种中小型广温性鱼类，广泛分布在北美大陆的江河湖泊中，于1993年由珠江水产研究所从美国引进。黑莓鲈适应能力强，其生存水温1～38 ℃，最适生长水温15～30 ℃，为偏肉食的杂食性鱼类，抗病能力强，易于饲养，肉质紧密，味道鲜美，近年来在珠三角和国内其他地区均有养殖。2014年8月，深圳某养殖场的黑莓鲈发生发病死亡，发病率约为50%，死亡率为30%～40%，病鱼的主要症状表现为鱼眼球突出，鳃丝发白，体表出血；肝脏、肾脏有出血点；胆囊、脾脏肿大；肠道有乌黑色内容物，肛门红肿。自患病鱼体内分离纯化得到优势菌株B017，经鉴定为类志贺邻单胞菌。

类志贺邻单胞菌为革兰氏阴性杆菌，广泛分布于自然界，尤其是水体及动物体内，是一种世界性分布的细菌［1-4］。有报道显示，类志贺邻单胞菌可引起中华鳖（Trionys sinensis）、暗纹东方鲀（Takifagu obsurus）、鲟（Huso dauricus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）等水生动物发病死亡［1-6］。但类志贺邻单胞菌能引起黑莓鲈发病死亡，还未曾有报道。通过回归感染等实验，证明其为引起黑莓鲈发病的致病菌；通过药敏试验，发现了几种该菌敏感的药物。通过本实验，为黑莓鲈的健康养殖和病害防治提供了一定的理论基础，对黑莓鲈的顺利推广具有重要意义。

1　样品及样品处理

病样采自深圳市某黑莓鲈养殖场，具有明显的临床症状。健康黑莓鲈购于广州市某养殖场，规格为7.9±1.1 cm，约400尾，暂养于实验室水族箱中供人工感染试验。暂养期间，每天早晚投喂一次，以30 min内吃完为宜并清污，及时剔除死亡和淘汰活力弱个体，暂养时间为10 d。人工感染试验前48 h停止投食。

2　实验方法

2.1 病原的分离和纯化

选取具有典型症状的濒死黑莓鲈，用灭菌生理盐水清洗体表。无菌条件下，分别取其肝、脾、肾和出血点处肌肉，于1.5 mL离心管中，剪碎混匀。取约0.5 g样品放在另一个离心管中，然后加入0.5 mL的生理盐水，用灭菌的研磨棒充分研磨，取200 μL组织悬液，分别涂布于脑心浸出液琼脂培养基和血琼脂平板上，28 ℃培养24 h，挑取优势菌落，于普通培养基（NA）上经2次纯化培养后，得到菌株B017。

2.2 菌落保存

将B017划线于NA斜面上，28 ℃培养24 h后，用移液器加入1 mL的淡水保种液，振荡器充分振荡后，将菌液移取至保种管中，-80 ℃保存，备用。

2.3 形态观察

取NA平板上第二次纯化的菌株，经革兰氏染色后，油镜镜检。

2.4 感染试验

2.4.1 回归感染试验

回归感染试验分3个实验组和1个对照组。将活化后的B017，接种于脑心浸出液，28 ℃恒温振荡培养24 h后，取1 mL培养液3 000 rmp/s离心后，弃上清，加入1 mL生理盐水，振荡混匀，100倍稀释。

试验组和对照组各随机挑取15尾黑莓鲈。试验组腹腔注射菌液0.2 mL/尾，对照组腹腔注射生理盐水0.2 mL/尾。试验期间水温27.0±0.5 ℃，连续7 d观察并记录各组鱼的发病和死亡情况。并对死亡黑莓鲈及时进行解剖和病原菌的再次分离。采取平板落菌的方法，计算得菌液浓度约为4.0×108cfu/mL。

2.4.2 半致死浓度

根据文献［3-4］中测定方法，随机挑选105尾黑莓鲈，分7组，6个实验组，1个对照组，每组各15尾。

将细菌纯化培养物按2.4.1的方法制得后，用无菌生理盐水洗涤并制成细菌悬液，菌液浓度为：1× 103cfu/mL、1×104cfu/mL、1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL，每尾注射0.2 mL，对照组每尾注射生理盐水0.2 mL。试验期间水温保持在27.0±0.5 ℃，连续 7 d观察并记录各组鱼的发病和死亡情况，及时清除死亡个体。

2.5 病原菌鉴定

2.5.1 生理生化鉴定

用接种环和接种针挑取单菌落，分别进行AHM试验，细菌的动力试验，氧化酶试验，葡萄糖、蔗糖等生化鉴定试验，用BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行鉴定。

2.5.2 16S rRNA 序列同源性分析

取纯化后的细菌，通过核酸抽提，PCR扩增，电泳，切胶回收后，将回收产物送华大基进行测序。通过已测得的序列与GenBank中临近种属的16S rRNA 序列进行相似性比对，确定其物种。

2.5.3 序列分析与系统发育树的构建

采用GenBank数据库中Blast软件对测序得到序列进行相似性比较。采用MEFA 4.0 软件进行多重序列匹配分析，用邻接发（Neighbor-Joining，NJ）构建系统发育树，并通过自举分析进行置信度检测，自举数集为1 000。

2.6 药物敏感试验

药敏试验采用K-B琼脂法。将制成的2.0×108cfu/ mL菌悬液，取0.1 mL，用涂布棒均匀涂布于NA平板上。用无菌镊子将抗生素纸片紧贴在平板表面，于28 ℃下恒温培养24 h。记录各药敏纸片抑菌圈的直径，根据药敏纸片的抑菌范围解释标准判断试验结果。

3　结果与分析

3.1 病原菌菌落形态特征

在NA平板上菌落呈圆形、淡黄色不透明，表面湿润、光滑、微隆起、边缘整齐，直径为1～3 mm。在血琼脂平板上呈灰白色，不溶血。镜检可见红色短直杆菌，两端钝圆，多单个散开分布。

3.2 回归感染试验

如表1所示，分离菌株对黑莓鲈有较强的致病性，人工感染玫瑰鲈的死亡率为100%。与养殖场病鱼的症状相同，将病鱼送回实验室进行检测，再次分离到相同的病原菌。

表1 B017对健康黑莓鲈人工感染试验结果

3.3 半致死浓度试验

根据表1中鱼的死亡结果，用 SPSS 13.0 计算 B017 得 LD50=2.6×104cfu/g。

3.4 生化鉴定结果

AHM培养基鉴定为阳性，运动力阳性，氧化酶试验阳性，吲哚试验阳性，能发酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七叶苷及水杨苷等5种糖类，脱脂奶平板试验阴性，经BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统鉴定，B017为类志贺邻单胞菌（鉴定率为99.9%，T值为0.95，鉴定结果极好）。

3.5 基于16S rRNA基因序列同源性去顶菌株B017的系统发育地位

用16S rRNA通用引物扩增B017 菌株的16S rRNA基因片段，得到一长度约为1 500 bp的片段。所测基因序列（登录号：KC825332）与已登陆的类志贺邻单胞菌16S rRNA相应基因序列的同源性为98%～99%，从中选择同源性较高的类志贺邻单胞菌以及弧菌科其它菌属细菌16S rRNA 基因序列，并以柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）为外群，用MEGA 4.0 软件通过邻接法进行系统发育分析，发现B017与类志贺邻单胞菌聚为一簇。

3.6 药敏试验结果

用35种常用的抗生素药物对菌株B017进行药物敏感性试验，试验结果显示：该菌株对氨曲南等26种抗生素敏感，对氨苄西林等5种抗生素中介，对麦迪霉素等4种抗生素耐药（如表2所示）。

表2 药物敏感性试验

4　讨论

日益严重的药物残留、环境污染和细菌耐药问题已成为一个世界关注的兽医公共卫生问题。对分离到的该致病菌株耐药性分析发现，该菌对氨曲南、头孢唑啉等药物敏感，对氨苄西林等中介，对克林霉素、万古霉素耐药。该结果与陆文浩等［7］和陈林等［8］的试验结果不同：陆文浩等分离的菌株对头孢唑林、头孢呋辛和四环素均中介；陈林等分离的菌株对复方新诺明耐药，对四环素、阿米卡星和庆大霉素等中介。这些菌株间的耐药性差异可能与分离地方不同、环境不同或者宿主不同有关，也可能是抗生素滥用的结果，这势必为类志贺邻单胞菌疾病的防治带来不利影响。

［1］李耀国，肖调义.转基因抗病草鱼研究进展［J］.生物技术通报，2011，（1）：26-28.

［2］沈建忠.动物毒理学［M］.北京：中国农业出版社，2002.

（编辑：晏兵兵）

S435.111.47

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1006-799X（2016）13-0126-03