弥漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因检测

翟玉娟王建波肖华静赵 丽邱 莹



·论著·

弥漫性掌跖角化病一家系角蛋白9基因检测

翟玉娟1王建波2肖华静1赵 丽1邱 莹1

目的： 检测弥漫性掌跖角化病一家系中的KRT9基因突变情况。方法： 提取该家系中3例患者和3名家系正常成员及100名健康对照的外周血DNA，采取PCR扩增KRT9基因序列，ABI PRISM-3700测序仪检测KRT9基因突变情况。结果： 该家系中3例患者存在KRT9基因上第487位C＞T突变，而该家系的正常成员及健康对照未检测到突变。结论： KRT9基因突变C487T可能与本家系弥漫性掌跖角化病发病有关。

弥漫性掌跖角化病； 白癜风； 甲亢； 角蛋白9基因

弥漫性掌跖角化病是一种以手掌和足跖表皮角化过度为特征的难治性皮肤病，是掌跖角化病（palmoplantar keratoderm，PPK）中最常见的类型，为常染色体显性遗传。其又分为弥漫性表皮松解型掌跖角化病（diffuse epidermolytic PPK，DEPPK）和弥漫性非表皮松解型掌跖角化病（diffuse non-epidemaolytic PPK，DNEPPK），前者较为常见。DEPPK主要表现为手掌和足跖弥漫性角层增厚，病变部位周边有明显的红斑边缘，部分病例可伴有指关节垫［1，2］。

随着遗传学及分子生物学的发展，针对DEPPK致病基因的研究已取得很大进展。1992年，Reis等采用遗传连锁分析方法首次将德国一DEPPK家系的突变基因定位于17q12-q21，而后通过基因测序的方法证实DEPPK的致病基因即为位于该区域的KRT9基因［3，4］。随后，国内外学者开展一系列不同DEPPK家系的KRT9基因检测工作。迄今，已在不同DEPPK家系的KRT9基因中检测到20余种不同的突变（www.Interfile.org），其中R163W最为常见［5］。目前报道的中国人DEPPK家系KRT9基因突变有以下几种：N160S、R162Q、L167S、L159F、497delAinsGGCT、N160H和R163W［6］。

1　先证者资料

患者，男，29岁。掌跖角化过度29年，面部、四肢白斑4年，发现甲亢2年。患者出生后3个月掌跖部开始出现弥漫性角化，随着年龄增加掌跖弥漫性角化过度明显加重，局部色泽淡黄，表面光滑，多处皮损脱屑、皲裂。4年前手掌开始出现散在色素脱失斑，随后半年内色素脱失斑先后累及足背、双下肢和面部。2年前患者因双下肢乏力查血 FT3：17.79 pmol/L （3.80～6.00 pmol/L），FT4：47.27 pmol/L（7.90～14.40 pmol/L），TSH：0.020 uIU/mL（0.340～5.600 uIU/ mL），被诊断为甲状腺功能亢进症（hyperthyroidism，简称甲亢）。体格检查：一般情况好，各系统检查未发现明显异常。皮肤科检查：掌跖可见弥漫性淡黄色角化增厚组织，界清，表面干燥、质硬，有少量脱屑和皲裂，角化性皮损边缘有明显红斑（图1a、b）。面部、双手、双下肢径前和双足背可见散在色素脱失斑，呈乳白色，大小不一，形状多样；双手掌弥漫性色素脱失，并蔓延至双手腕部（图2a、b）。诊断：（1）弥漫性掌跖角化病；（2）白癜风；（3）甲状腺功能亢进症。

图1　a：双手掌弥漫性淡黄色角化增厚组织并色素脱失；b：双足掌弥漫性淡黄色角化增厚组织 图2 a：双手背弥漫性乳白色色素脱失斑；b：双足背散在乳白色色素脱失斑

2　家系调查

父母非近亲结婚，家族四代共有弥漫性掌跖角化病13例，男6例，女7例，发病时间均为出生后3个月左右，皮损均表现为掌跖弥漫性角化过度。目前未发病者其子代均正常，发病无性别差异，无隔代遗传现象，符合常染色体显性遗传（图3）。另外，所有家族成员中除先证者外，无患白癜风或甲亢者。

3　家系角蛋白9基因检测

3.1实验方法 在签署书面知情同意书后，对先证者（III 4）和其家系中另外2例患者（III 2、IV 2）和3例未患病成员（II 9、III 5、III 12）进行血样采集，每例抽取外周血3 mL。应用QIAamp DNA blood mini kit（德国Qiagen公司）提取基因组DNA。另外，以同样的方法提取100例无亲缘关系的健康对照个体基因组DNA作为对照。通过美国国立图书馆网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取角蛋白9（keratin 9，KRT9）基因mRNA序列，经BLAST比对得到该基因的基因组序列（http：//www.Genome.UCSC.edu/），应用Primer 3.0设计特异性引物对KRT9基因8个外显子进行 PCR扩增，扩增产物纯化后直接在 ABI PRISM-3700测序仪（Applied Biosystems）上进行测序，测序结果与人类基因组KRT9序列进行比较，同时使用Phred-Phrap-Consed软件包Versionl 2.0进行分析。

3.2结果 PCR产物经测序发现，3例患者KRT9基因的第487位碱基胞嘧啶（C）转化成胸腺嘧啶（T），使得KRT9基因的第1号外显子163位密码子由CGG突变成TGG，导致正常的精氨酸（Arginine，Arg）由色氨酸（Tryptophan，Trp）替代（图4）。家系中3名正常人及100名无亲缘关系的正常人均未见其改变，通过 Polyphen2.0（http：//genetics.bwh.harvard.edu/ pph2/）对突变蛋白结构预测得分为1.0，可能是致病的突变。

图3　患者家系图

图4　先证者及家系中正常人KRT9基因第1外显子部分测序结果

4　讨论

本家系的突变位点即是 DEPPK中最常见的R163W突变，即487 C＞T突变使得KRT9基因的第1外显子163位密码子由CGG突变成TGG，导致正常的精氨酸被色氨酸替代。有研究表明，KRT9棒状功能域的1Aa螺旋区的前15个氨基和2Ba螺旋区末端的10～11个氨基酸对角蛋白中间丝的聚集和稳定至关重要［1］。163位是棒状功能域1Aa螺旋区的第12位氨基酸，因此R163W突变将影响角蛋白中间丝的聚集，破坏中间丝网状系统的形成，从而导致该病的发生。另外，有研究发现角蛋白1（Keratin l，KRT1）基因突变也可以引起DEPPK，目前证实的KRT1基因突变有4种：I497T、L437P、S223L和F231L［7-9］。

先证者从临床特征看为DEPPK，而且本家系的突变位点也是DEPPK中最常见的R163W突变（新版本的角蛋白9序列发表于 2005年4月23日［gi：55956898］，突变R162W更换为R163W）。但先证者同时伴发白癜风和甲亢实属罕见。通过文献检索后确定，目前为止本病例三病共发于一个体现象应为首次报道。2004年冯兰珍等［10］曾报道残毁性掌跖角化病伴白癜风一例，其白癜风皮损在患者腹部，不与掌跖角化皮损重合，此与本病例不同。掌跖角化病患者皮损过度角化，出现严重脱屑或皲裂，皮损中炎性细胞浸润较多时有可能损伤到黑素细胞，导致黑素细胞密度降低或脱失，从而导致继发性白癜风。但临床上掌跖角化病合并白癜风的患者确为少数，两者并发也很可能是随机事件。然而，白癜风合并甲亢已多有报道。目前研究认为，白癜风和甲亢均为与遗传相关的自身免疫性疾病，并有学者通过调查认为白癜风和甲亢患者中两者并发率高达25%［11］；在国内，有学者研究发现两者并发率为8.2%［12］。最新研究证实，白癜风和自身免疫性甲状腺病存在相关致病基因，即NLRP1基因［13］。故有学者提出对白癜风患者应该常规筛查甲状腺疾病［14］。

总之，先证者为三病并发的特殊病例，KRT9基因R163W突变是此DEPPK家系的明确致病因素，先证者DEPPK与白癜风发病可能存在继发或加重影响因素，与甲亢则可能为相互独立事件，而白癜风与甲亢相互伴发的现象提示临床工作中应重视和建立两病相互伴发的筛查意识。

［1］Li M，Yang LJ，Hua HK，et al.Keratin-9 gene mutation in epidermolyticpalmoplantarkeratodermacombinedwith knuckle pads in a large Chinese family［J］.Clin Exp Dermatol，2009，34（1）：26-28.

［2］黎明，顾有守.弥漫性掌跖角化症合并指节垫一家七例［J］.中华皮肤科杂志，1999，32（6）：390.

［3］Reis A，Kuster W，Eckarch R，et al.Mapping of a gene for epidermolytie palmoplantar keratoderma to the region of the acidic keratin gene cluster at17q1-q21［J］.Hum Genet，1992，90（1-2）：113-116.

［4］Reis A，Hennies HC，Langbein L，et al.Keratin 9 gene mutations in epidermolytic palmoplantar keratoderma（EPPK）［J］.Nat Genet，1994，6（2）：174-179.

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［6］李明，张国龙，翟建新，等.一个弥漫性表皮松解性掌跖角化病家系角蛋白9基因R162W突变［J］.中华医学遗传学杂志，2008，25（4）：387-389.

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（收稿：2016-02-01 修回：2016-02-16）

Mutations of keratin 9 gene in one family with diffuse plamoplantar keratoderma

ZHAI Yujuan1，WANG Jianbo2，XIAO HuaJing1，ZHAO Li1，QIU Ying1.
1.Department of Dermatology，Jining No.1 People's Hospital，Jining 272000，Shandong，China；2.Department of Dermatology，Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou 450003，China
Correspondence author：QIU Ying，E-mail：qiuyingjn@163.com

Objective：To identify mutations of keratin 9 gene（KRT9）in a family with diffuse plamoplantar keratoderma（DPPK）.Methods：DNA was extracted from the peripheral blood of the patients in a family （3 patients and 3 normal members）and 100 healthy controls.All the exons of KRT9 were amplified by PCR and direct DNA sequencing was performed by ABI PRISM-3700 sequenator.Results：A missense mutation （487C＞T）in the KRT9 gene was identified in the three patients and none of mutation was found in 3 normal family members and healthy controls.Conclusion：The mutation of C487T in KRT9 gene is associated with the onset of diffuse palmoplantar keratoderma in the family.

diffuse plamoplantar keratoderma；vitiligo；hyperthyroidism；KRT9 gene

邱莹，E-mail：qiuyingjn@163.com

1济宁市第一人民医院，山东济宁，272000

2河南省人民医院皮肤科，河南郑州，450003