液体培养法、PCR法和SAT法在解脲支原体检测中的应用比较

曾成龙 冯 婷 闫 丹 王胜春



·论著·

液体培养法、PCR法和SAT法在解脲支原体检测中的应用比较

曾成龙 冯 婷 闫 丹 王胜春

目的： 比较液体培养法、聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SAT）在解脲支原体（Uu）检测中的诊断价值。方法： 应用液体培养法、PCR法和SAT法对77例疑似男性泌尿生殖系统感染患者尿道和23例女性宫颈的分泌物进行解脲支原体的检测。结果： 100例患者中阳性29例（29.00%），其中男15例，感染率19.48%（15/77），女14例，感染率60.87%（14/23）。SAT法的敏感性为100%高于液体培养法（89.66%）和PCR法（86.21%），差异无统计学意义（P＞0.05），SAT法的特异性为84.50%低于液体培养法（98.59%）和PCR法（98.59%），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论： 以上三种方法均可用来检测Uu，SAT敏感性强，特异性低，适用于检测病原微生物含量不高的标本。

液体培养法； 聚合酶链式反应； 实时荧光核酸恒温扩增检测技术； 解脲支原体

目前解脲支原体（Uu）检测方法多采用液体培养法，它是通过Uu分解不同底物改变液体培养基pH，使培养基颜色变化，间接判断其生长同时进行药敏试验。但能分解尿素的细菌都可导致培养基颜色发生变化，例如流感嗜血杆菌、克雷伯氏菌、乳酸菌种、变形杆菌、耐苯唑西林金黄色葡萄球菌等［2］，故单纯依靠颜色的变化来判断会存在假阳性，必须配合其他的检测手段才能确定结果是否准确［3］。目前市场上出现以实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）作为手段的试剂产品，本研究特对100例疑似泌尿生殖系统感染患者，采集男性尿道或女性宫颈分泌物，同时应用液体培养法、PCR法和SAT法进行Uu的检测，对这3种方法的诊断价值进行比较，现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料 2015年2月～6月STI门诊疑似泌尿生殖道感染患者共 100例，其中男77例（77.00%），女23例（23.00%）；年龄18～78岁，平均（35.52±11.57）岁。纳入标准：（1）近期有过不安全性接触患者；（2）有泌尿生殖道感染临床症状；（3）患有其他性病而来医院查体患者，排除1周内已使用相关药物进行治疗的患者。

1.2取材 用消毒棉拭子伸入男性尿道约2～4 cm，女性宫颈管内1～2 cm进行取材。第一个棉拭子立即接种培养，第二个棉拭子洗涤于装有1 mL生理盐水的EP管，第三个棉拭子生理盐水洗脱后，倒入尿样保存管，将EP管和尿样保存管于-20℃冰箱保存。

1.3试剂和方法 液体培养法试剂生产厂商是法国Biomerieux'SA，实时荧光定量PCR方法试剂盒由泰普生物工程有限公司提供，SAT法试剂生产厂商是上海仁度生物科技有限公司，PCR仪器TL988由西安天隆科技有限公司提供。

1.4操作 严格按试剂盒说明书进行各项操作。

1.5结果判定 以2种以上（包括2种）检测方法的结果均阳性为真阳性，结果均阴性为真阴性。灵敏度=真阳性例数/（真阳性+假阴性）例数×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性+假阳性）例数×100%。

1.6统计学方法 利用SPSS 19.0软件进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1检测结果 100例患者中，Uu真阳性 29例（29.00%），其中男15例，感染率19.48%（15/77）；女14例，感染率60.87%（14/23），两者差异有统计学意义（P＜0.05），与以往文献报道一致［3］。

2.23种方法检测解脲支原体的结果比较 见表1。

表1　3种方法检测解脲支原体的结果比较 例

2　讨论

Uu是人类泌尿生殖道的常见病原体，已作为临床常规检测项目，越来越多的检测方法也逐渐被人们探索、建立和成熟，为临床诊断提供着愈加可靠的信息［4］，故本研究选择Uu作为实验项目进行多种方法学比较研究。目前临床上Uu的检测方法是液体培养法和检测病原体DNA的PCR法，液体培养法操作简便且能同时进行药敏试验，包括基层在内的大部分医院普遍使用；PCR技术能快速、准确、灵敏地检出病原体的DNA，技术条件符合的医院都有开展。SAT法是将核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，它的原理是在42℃条件下，首先将提取的靶标核酸（RNA）通过M-MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光，该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，达到检测目的［5］。该技术在临床上已经应用于检测Ct、Uu、NG、Mg、Mp、EV和EV71等。

SAT法其靶标为RNA，初始模板数量大，因为一个病菌内有10000多条16sr RNA，而且每条RNA又可以扩增100～1000条，故具有高敏感性，从原理上可知，培养法和PCR法敏感性低于SAT法，和本研究结论一致。SAT法其靶标和核酸产物均为RNA，均为特异性提取、扩增和检测，特异性高［3］，但本研究液体培养法和PCR法的特异性更高，SAT特异性稍差。SAT法的特点还在于它检测的是病原体16s rRNA，因活菌中才有完整的RNA片段，因此相当于检测活菌，有利于临床用药后的疗效监测。RNA在环境中极不稳定，容易降解，大大降低了核酸扩增检测交叉污染引起的假阳性问题，污染概率小［6］。总之，以上三种方法均可用来检测Uu，SAT技术敏感性强，容易出现假阳性，应用SAT法注意结合临床辨别假阳性，尤其是无症状患者和已治疗但未完全清除的患者，往往需要其他检测方法进行复查。目前临床上Uu检测方法使用最多的还是液体培养法和PCR法，而SAT法更适合应用于检测标本中含量不高的病原微生物，例如分枝杆菌和生殖支原体等［7］。

［1］Vancutsem E，Soetens O，Breugelmans M，et al.Modified real-time PCR for detecting，differentiating，and quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum［J］.J Mol Diagn，2011，13（2）：206-212.

［2］刘会彩.不育男性精子形态和解脲支原体感染的相关性研究［J］.检验医学与临床，2015，12（15）：2208-2209.

［3］张睿，叶阿里，孔令君，等.临床患者三种性传播疾病分子生物学检测分析［J］.现代检验医学杂志，2015，30（3）：107-108.

［4］张艳，李苏利.解脲支原体检测方法研究现状［J］.临床军医杂志，2014，42（9）：961-963.

［5］王永忠，张宏宇，刘小琴.痰液标本结核分支杆菌RNA恒温扩增检测及临床应用［J］.山东医药，2011，51（41）：83-84.

［6］张津萍，龚匡隆，尤永燕，等.实时荧光核酸恒温扩增法检测泌尿生殖道淋球菌感染［J］.国际皮肤性病学杂志，2010，36（3）：137.

［7］Cui Z，Wang Y，Fang L，et al.Novel real-time simultaneous amplification and testing method to accurately and rapidly detect mycobacterium tuberculosis complex［J］.J Clin Microbiol，2012，50（3）：646-650.

（收稿：2016-01-05 修回：2016-03-02）

Comparison of SAT，Liquid culture and PCR in detection of ureaplasma urealyticum

ZENG Chenglong，FENG Ting，YAN Dan，WANG Shengchun.
Army Skin Disease Research Institute，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China
Corresponding author：WANG Shengchun，E-mail：wangsc@fmmu.edu.cn

Objective：To compare the application of liquid culture，PCR and SAT in the diagnosis of Ureaplasma urealyticum（Uu）.Methods：Uu was detected from specimens of 77 males'urethra and 23 females' cervix by liquid culture，PCR and SAT.Results：The Uu was detected in 100 specimens，giving a positivity rate of 29%.Out of the 29 positive specimens，15（19.48%）were from males and 14（60.87%）were from females.The sensitivity of SAT was 100%which was higher than liquid culture（89.66%）and PCR （86.21%）.However，there were no significant differences among the three methods（P＞0.05）.The specificity of SAT was 84.50%which was lower than liquid culture（98.59%）and PCR（98.59%），with significant differences（P＜0.05）.Conclusion：Liquid culture，PCR and SAT can be used in the detection of Uu.SAT has higher sensitivity and lower specificity，which is more suitable for detecting low concentration of Uu.

Liquid culture；PCR；SAT；ureaplasma urealyticum

王胜春，E-mail：wangsc@fmmu.edu.cn

第四军医大学西京皮肤医院，西安，710032