真核细胞翻译起始因子4E在皮肤基底细胞癌中的表达

邓 越 刘海东 庄 乐 马伟元



·论著·

真核细胞翻译起始因子4E在皮肤基底细胞癌中的表达

邓 越 刘海东 庄 乐 马伟元

目的： 检测皮肤基底细胞癌中真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）的表达。方法： 采用免疫组化PV-9000法和Real-time PCR法分别检测20例皮肤基底细胞癌及20名健康皮肤组织中eIF4E蛋白及mRNA的表达。结果： 基底细胞癌和健康皮肤组织中eIF4E蛋白MOD值分别为（0.198± 0.031）和（0.096±0.015），mRNA相对表达量分别为（2.32±1.00）和（1.24±0.17），差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论： eIF4E可能参与皮肤肿瘤的发病过程。

基底细胞癌； 真核细胞翻译起始因子4E； 免疫组化； 实时荧光定量PCR

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1临床资料 收集2014年1月至2015年1月山东大学齐鲁医院皮肤科病理室诊断的BCC蜡块标

本20例。其中男女各半，年龄59～74岁，中位年龄68岁，病史1个月～12年。发病部位均为颜面部，其中眼周4例，鼻翼5例，鼻唇沟4例，面颊5例，颞部2例。病理分型：结节溃疡型9例，色素型5例，浅表型3例，硬皮病样型1例，腺样型2例。另取皮肤外科术中废弃的健康皮肤标本20例作为对照组，两组在年龄、性别、取材部位上相匹配。

1.1.2主要试剂 浓缩型兔抗人eIF4E多克隆抗体（货号：ab76256，规格：100 μL/支）购于美国Abcam生物工程有限公司，二步法免疫组化试剂盒（货号：PV-9000，规格：5 mL/支）、DAB显色液（货号：ZLI-9019，规格：10 mL/瓶）购于北京中杉金桥生物技术有限公司。离心柱型石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒（货号：RP5321，规格：50次）、Super M-MLV反转录酶（货号：PR6502，规格：10000 U）、2×Super SYBR real-time PCR premixture（货号：PR7031，规格：125次）购于北京百泰克生物技术公司，其它实验用品由山东大学齐鲁医院皮肤科实验室提供。

1.2方法

1.2.1免疫组化法检测eIF4E蛋白的表达 蜡块3 μm厚连续切片，常规脱蜡至水，EDTA（PH=9.0）修复液高温高压修复3.5 min，4℃冷却1 h。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，山羊血清37℃封闭20 min。滴加兔抗人eIF4E多克隆抗体（工作浓度为1∶50），4℃孵育过夜。严格按照PV-9000试剂盒说明书中步骤滴加二抗。显微镜控制DAB显色，自来水终止显色反应。苏木精复染，盐酸乙醇分化，氨水返蓝，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

结果判定：由两位高年资病理医师进行，每张切片随机选取5个不连续具有代表性的高倍镜视野（40×）进行拍照，曝光条件均一致，OLYMPUS-DP2-BSW全自动图像分析系统进行彩色图像的采集与储存。用image pro-plus 6.0专业图像分析软件对图像进行半定量分析，计算出每张切片的平均光密度值MOD，MOD=sum（IOD）/sum（area）。MOD值越高，表达越强。

1.2.2Real-time PCR法检测eIF4E mRNA的表达

①RNA提取：按RNA提取试剂盒说明书提取健康对照皮肤及基底细胞癌中的总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量和纯度；②cDNA链合成：逆转录反应体积为20 μL，包括经检测合格的RNA 0.5 μg、随机引物200 μg、50 μM oligo（dT）1 μL、5×Reaction Buffer 4 μL、10 mM dNTP Mix 2 μL、RNase-free ddH2O 10 μL、Thermo M-MLV（200 U/μL）1 μL，反应条件：25℃ 10 min，42℃50 min，反应产物-80℃保存备用；③荧光实时定量PCR：引物由上海生工生物工程有限公司合成，内参基因GAPDH扩增产物226 bp；eIF4E mRNA扩增产物246 bp（表1）。

表1　eIF4E、GAPDH扩增引物序列表

实时定量PCR：使用定量PCR反应仪检测，采用20 μL反应体系。在ABI 7500荧光定量PCR仪上进行如下反应：95℃起始模板变性2 min（1循环），95℃模板变性15 s，65℃退火、延伸40 s收集荧光信号（40循环），实验重复3次取平均值，得到每个标本不同指标的Ct值，以GAPDH mRNA的量为内参照，根据公式2-△△Ct计算出所测指标的相对表达量（表2）。

表2　定量PCR反应仪所测指标相对表达量

2　结果

2.1eIF4E蛋白的表达 eIF4E在健康对照皮肤的表皮中未见表达（图1a），其MOD值为（0.096±0.015）；基底细胞癌肿瘤团块阳性表达率为95%（19/20），eIF4E主要定位于细胞浆中，部分细胞核中亦有表达，呈弥散性或散在性分布的棕黄色颗粒（图1b），MOD值为（0.198±0.031）。由此可见，基底细胞癌中eIF4E蛋白的表达较健康皮肤明显上调，差异具有显著性意义（t=-13.497，P＜0.05）。

图1　a：eIF4E蛋白在健康皮肤表达阴性；b：基底细胞癌皮损中表达阳性（PV-9000，×400）

2.2eIF4E mRNA的表达 eIF4E mRNA在基底细胞癌中呈现高表达（2.32±1.00），在健康皮肤组中呈现低表达（1.24±0.17），两者比较差异具有统计学意义。（t=-4.807，P＜0.05）。

3　讨论

eIF4E在多种实体肿瘤中呈现过表达，过表达eIF4E通过选择性地增加某些增殖相关基因和促生存基因（如c-myc、cyclinD1、ODC、VEGF、FGF2）的mR-NA翻译来促使细胞表型的转变［9］。目前研究主要发现两种作用机制：①eIF4E因子可特异性的与真核细胞mRNA的5'末端帽结构结合，参与mRNAs向核糖体的物质转运；②eIF4E可显著增加eIF4A解旋酶的活性［10］，eIF4E和eIF4A因子可协同解开mRNA 5' UTRs二级结构［11］，从而启动特定mRNA的翻译，显著改变细胞的表型，促进细胞增殖和诱导细胞转化肿瘤形成和转移［12］。但有关皮肤肿瘤，特别是基底细胞癌中eIF4E的表达情况，迄今尚未见国内外报道。

本研究表明，eIF4E蛋白和mRNA在BCC组织中呈高表达，由此推测其可能参与BCC的发病过程。大量研究认为引起BCC发病的最主要诱因是日光中UV导致的 DNA分子破坏从而触发 p53凋亡通路［13］，而Akt/mTOR通路拮抗p53的促凋亡作用，当其调节失控时就会促进细胞的转型和异常增殖［14］，因此BCC的发生与mTOR信号通路调节异常密切有关。已有研究证实eIF4E能够上调Akt蛋白的表达［13］，推测其可能作为mTOR信号通路的重要靶点。其次，eIF4E亦能调节 VEGF、Cyclin D1因子的表达［17］，抑制细胞凋亡，促进内皮细胞的形成，促进血管生成和肿瘤生长［15］。以上推测可能是 eIF4E在BCC发病过程中的作用机制，我们将在今后进行进一步的实验研究。

［1］Grant DJ，Ernest PW，Allen RP，et al.The alveolate translation initiation factor 4E family reveals a custom toolkit for translational control in core dinoflagellates［J］.BMC Evol Biol，2015，15（1）：14.

［2］吕红琼，张华，王平，等.原癌基因eIF4E与bFGF在乳腺癌中的表达及其临床意义［J］.实用肿瘤学杂志，2007，21 （4）：306-309.

［3］Mona DA，Raefa AK，Nina SZ，et al.Expression of eukaryotic initiation factor 4E and 4E binding protein 1 in colorectal carcinogenesis［J］.Int J Clin Exp Pathol，2015，8（1）：404-413.

［4］Wang R，Geng J，Wang JH，et al.Over expression of eukaryotic initiation factor4E（eIF4E）and its clinical significance in lung adenocarcinoma［J］.Lung Cancer，2009，66 （2）：237-244.

［5］Luc F，Liwei Rong，Ola L，et al.eIF4E phosphorylation promotes Tumorigenesis and is associated with prostate cancer progression［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（32）：14134-14139.

［6］Songqing F，Suresh SR，John K，et al.Phosphorylated eukaryotic translation initiation factor 4（eIF4E）is elevated in human cancer tissues［J］.Cancer Biol Ther，2009，8（15）：1463-1469.

［7］Chantal SC，Antisar BK，Simon HR，et al.CD200-expressing human basal cell carcinoma cells initiate tumor growth ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（4）：1434-1439.

［8］Lyubomir AD，Darena R，Ivan B.Clinical variants，stages，and management of basal cell carcinoma［J］.Indian Dermatol Online，2013，4（1）：12-17.

［9］Muta D，Makino K，Nakamura H，et al.Inhibition of eIF4E phosphorylation reduces cell growth and proliferation in primary central nervous system lymphoma cells［J］.J Neurooncol，2011，101（1）：33-39.

［10］Kateryna F，Enkhee T，Angelie D，et al.Human eIF4E promotes mRNA restructuring by stimulating eIF4A helicase activity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（33）：13339-13344.

［11］Greco H，Hong Han，Valentina G，et al.Eukaryotic initiation factor 4E-3 is essential for meiotic chromosome segregation，cytokinesis and male fertility in drosophila［J］.Development，2012，139（17）：3211-3220.

［12］Ivan T，Nadeem S，Vincent LL，et al.Molecular dissection of the eukaryotic initiation factor 4E（eIF4E）export-competent RNP［J］.EMBO J，2009，28（8）：1087-1098.

［13］Gallagher RP，Hill GB，Bajdik CD，et al.Sunlight exposure，pigmentary factors，and risk of nonmelanocytic skin cancer.I.Basal cell carcinoma［J］.Arch Dermatol，1995，131（2）：157-163.

［14］Alexander GM，Samuel EB.Basal cell carcinoma：Pathogenesis，epidemiology，clinical features，diagnosis，histopathology，and management［J］.Yale J Biol Med，2015，88 （2）：167-179.

［15］张桂英，周双元，姚明珠，等.Akt和mTOR在皮肤基底细胞癌中的表达［J］.中华皮肤科杂志，2010，43（6）：426-427.

［16］Jeremy RG，Bruce WK，Thomas MV，et al.Therapeutic suppression of translation initiation factor eIF4E expression reduces tumor growth without toxicity［J］.J Clin Invest，2007，117（9）：2638-2648.

［17］吴文艺，张丽婷，郑志芳，等.eIF4E、p-eIF4E和Mcl-1在病理性瘢痕组织中的表达和意义［J］.中华整形外科杂志，2012，28（5）：360-365.

（收稿：2015-12-07 修回：2015-12-30）

Expression of eIF4E in basal cell carcinoma

DENG Yue1，LIU Haidong2，ZHUANG Le2，MA Weiyuan2.
Department of Dermatology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China Corresponding author：MA Weiyuan，E-mail：dermatologyqlh@163.com

Objective：To detect the expression of eukaryotic translation initiation factor 4E（eIF4E）in basal cell carcinoma（BCC）.Methods：The protein and mRNA expressions of eIF4E were detected by PV-9000 immunohistochemistry and real-time PCR in 20 patients with basal cell carcinoma and 20 healthy controls.Results：The MODs in BCC and controls were 0.198±0.031 and 0.096±0.015 respectively and the expression levels of mRNA were 2.32±1.00 and 1.24±0.17，with significant differences（P＜0.05）. Conclusion：eIF4E may involve in the pathogenesis of BCC.

basal cell carcinoma；eIF4E；immunohistochemistry；RT-PCR真核细胞翻译起始因子4E（eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E）是一种25KD的多肽，是真核细胞翻译起始和调控的核心部分，在蛋白质的翻译起始过程中发挥重要作用［1］。研究表明eIF4E在多种实体肿瘤（例如乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、子宫颈癌、白血病等）中高表达，与肿瘤的侵袭和转移呈现正相关［2-6］。基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC）占所有皮肤恶性肿瘤的70%［7］，虽发展较慢，很少发生远处转移（＜0.5%），但可引起严重的局部组织损坏［8］，加之其病因复杂，临床及病理表现多样，值得进行深入而系统的研究。本研究对eIF4E蛋白和mRNA在皮肤基底细胞癌中的表达水平进行研究，旨在初步探讨其在BCC发病中的作用。

马伟元，E-mail：dermatologyqlh@163.com

2014年山东省自然科学基金（编号：ZR2014HP007）

山东大学齐鲁医院皮肤科，济南，250012