肝纤维化模型中小鼠肝脏的病理变化及软肝冲剂的治疗作用

刘　有，张晓欢，白　剑，张丽萍，王学良



肝纤维化模型中小鼠肝脏的病理变化及软肝冲剂的治疗作用

刘有1，张晓欢1，白剑2,3*，张丽萍2，王学良2

1.解放军总医院海南分院，三亚572000；2.辽宁中医药大学，沈阳110847；3.中国人民解放军第三〇九医院器官移植研究，北京100091

[摘要]目的观察肝纤维化模型中小鼠肝脏的病理改变以及软肝冲剂对小鼠肝纤维化模型的治疗作用。方法将60只雄性SPF级C57B/L小鼠随机分为空白对照组、模型组、护肝片对照组、软肝冲剂低剂量组和软肝冲剂高剂量组，每组12只。空白对照组给予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；护肝片对照组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予护肝片0.1 mg/(kg·d)灌胃至第10周；软肝冲剂低剂量组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予软肝冲剂1 g/(kg·d)灌胃至第10周；软肝冲剂高剂量组给药剂量为5 g/(kg·d)，造模及给药方法与低剂量组相同。在第10周通过摘除眼球取血，检测小鼠血清中的透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、三型前胶原(PCⅢ)、四型胶原(Ⅳ-C)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)；检测肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量；计算肝脏指数；观察小鼠肝脏的HE染色和MASSON染色病理组织学改变。结果模型组与空白对照组比较，小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平显著升高(P<0.05)，肝脏组织中SOD显著降低(P<0.05)，MDA显著升高(P<0.05)，肝脏指数增加(P<0.05)，病理切片显示肝细胞坏死并出现脂肪空泡、纤维组织增生和炎细胞浸润，MASSON染色显示肝组织内出现明显脂肪空泡和纤维组织增生；软肝冲剂组与模型组比较，小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的水平显著降低(P<0.05)，肝脏组织中SOD显著升高(P<0.05)，MDA水平显著降低(P<0.05)，肝脏指数降低(P<0.05)，病理检查显示肝脏组织中无炎性浸润、脂肪空泡和纤维组织沉积，MASSON染色显示肝组织内出现明显脂肪空泡和纤维组织增生。结论CCl4腹腔注射可以形成小鼠肝硬化模型，病理改变以脂肪空泡出现和纤维化为主；软肝冲剂可以改善肝脏功能，减轻CCl4诱导小鼠肝纤维化程度。

[关键词]软肝冲剂；肝纤维化；SOD；MDA

0　引言

肝纤维化是多种慢性肝脏疾病发展到一定阶段的共同特征，从病理学角度上看，肝纤维化是肝细胞基质(Extra-cellular matrix，ECM)代谢异常，表现为ECM的合成增多而分解减少，最终导致其大量沉积的过程[1]。目前，中医药在我国已经被广泛应用于治疗慢性肝炎和肝硬化，临床实践证明，中医药在治疗肝纤维化领域中确实有独到之处，并取得了较好的疗效[2-4]。软肝冲剂是辽宁中医药大学附属医院的一种院内制剂，试剂是在继承已故全国名老中医、肝病专家王文彦教授的肝纤维化发病中心环节为“脾虚肝郁”，其他血瘀、水停皆由此产生的学术思想的基础上，并根据其经验方软肝煎通过现代制剂技术制成，对于肝硬化患者具有明确的治疗作用[5]。本实验在此基础上，采用CCl4腹腔注射的方法制作肝纤维化模型，观察肝脏的病理改变，并观察软肝冲剂对肝纤维化小鼠模型的治疗机制。

1　材料和方法

1.1实验动物和主要仪器C57B/L小鼠60只，体重(20±1)g，4～5周龄，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物许可证号:SYXK(辽)2010-0001。TBA-40FR全自动生化检测仪购自日本东芝公司；BS14-F8超细匀浆器购自成都一科仪器设备有限公司。

1.2试剂水合氯醛和CCl4均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；花生油为鲁花牌花生油；HA(货号:9063-50)、LN(货号:9074-50)、PCⅢ(货号:9071A-50)、Ⅳ-C ELISA(货号:9071C-50)检测试剂盒购自上海研晶生物科技有限公司；ALT(货号:20141129)和AST(货号:20141011)检测试剂购于四川迈克生物科技有限公司；SOD(A001-2)与MDA(A003-2)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；软肝冲剂购自辽宁中医药大学附属医院制剂室。

1.3实验分组和动物模型的制备取60只C57B/L小鼠,随机分为空白对照组、模型组、护肝片对照组、软肝冲剂低剂量组和软肝冲剂高剂量组，每组12只。空白对照组给予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；护肝片对照组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予护肝片0.1 mg/(kg·d)灌胃至第10周；软肝冲剂低剂量组给予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并从第3周起给予软肝冲剂1 g/(kg·d)灌胃至第10周；软肝冲剂高剂量组给药剂量为5 g/(kg·d)，造模及给药方法与低剂量组相同。

1.4病理学及血清指标检测在第10周通过摘除眼球取血，不抗凝，离心分离血清，通过721分光光度计，检测小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C的含量；通过TBA-40FR全自动血液生化分析检测ALT和AST的含量；计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏的重量/小鼠的重量；留取肝脏约0.5 g匀浆，用生理盐水冲掉残留血液，在匀浆器加入生理盐水，将肝组织研磨成0.5%、1%和10%的混悬液，在4 000 r/min离心15 min，通过721分光光度计，检测小鼠肝组织内SOD和MDA的活性；将剩余肝脏组织浸泡于5%的福尔马林溶液中固定，使用HE和MASSON染色，观察小鼠肝脏的病理组织学改变和纤维组织沉积情况。

2　结果

2.1软肝冲剂对CCl4肝纤维化小鼠肝脏病理变化的影响空白对照组小鼠肝细胞体积较大，呈多面体形，核大而圆，核膜完整，位于细胞中央；肝细胞索以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，板间为不规则的肝窦；肝细胞间连接紧密。模型组小鼠肝小叶界限不清，胞质内可见多个大小不等的脂肪空泡；出现炎性细胞浸润；肝细胞索排列紊乱；肝窦变窄。护肝片对照组和软肝冲剂低剂量组肝组织结构有所改善，肝细胞脂肪变性减轻，但仍有炎性细胞浸润与假小叶形成。软肝冲剂高剂量组肝组织结构有较明显改善，肝细胞脂肪变性显著减轻，未见炎性细胞浸润与假小叶形成。见图1、图2。

图1　各组小鼠肝脏HE切片(×200)

2.2软肝冲剂对CCl4肝纤维化小鼠肝脏指数的影响空白对照组与模型组肝脏指数比较差异有统计学意义，表明造模成功；护肝片对照组、软肝冲剂组与模型组肝脏指数比较差异有统计学意义(P<0.05)，表明软肝冲剂对改善肝纤维化有作用。见表1。

图2　各组小鼠肝脏MASSON染色(×200)

组别肝脏体重(g)小鼠体重(g)肝脏指数(%)空白对照组0.63±0.2221.46±1.953.0±0.7*模型组0.94±0.4419.22±1.914.2±1.1护肝片对照组0.75±0.1321.09±1.983.5±0.4*软肝冲剂低剂量组0.68±0.1221.14±2.153.4±0.3*软肝冲剂高剂量组0.71±0.1521.21±2.143.5±0.2*

注：*与模型组比较，P<0.05

2.3软肝冲剂对CCl4肝纤维化小鼠肝功能指标的影响小鼠经CCl4造模后，与空白对照组比较，小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量明显增加，提示肝细胞受损，造模成功(P<0.05)；治疗后，护肝片对照组与模型组比较，血生化指标差异有统计学意义(P<0.05)，与空白对照组比较，血生化指标差异亦有统计学意义(P<0.05)。软肝冲剂组与模型组比较，血生化指标差异有统计学意义(P<0.05)，与空白对照组比较，血生化指标差异亦有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　软肝冲剂对CCl4肝纤维化小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响

注：*与模型组比较，P<0.05；#与空白对照组比较，P<0.05

2.4软肝冲剂对小鼠肝组织内SOD和MDA的影响结果表明，小鼠造模后与空白对照组比较，血清中SOD水平明显下降，MDA含量明显上升，提示肝细胞受损，造模成功(P<0.05)；护肝片对照组与模型组比较，SOD和MDA差异有统计学意义(P<0.05)。软肝冲剂低剂量组与模型组比较，SOD和MDA差异有统计学意义(P<0.05)，表明低剂量软肝冲剂对肝纤维化具有治疗作用。软肝冲剂高剂量组与模型组比较，SOD和MDA差异有统计学意义(P<0.05)，且与空白对照组比较差异无统计学意义，表明高剂量软肝冲剂对肝纤维化具有明显的治疗作用。见表3。

表3　软肝冲剂对小鼠肝组织脂质过氧化损伤的影响

注：*与模型组比较，P<0.05；#与空白对照组比较，P<0.05

3　讨论

现代医学认为，肝脏纤维化过程是ECM的异常沉积并释放入血的过程，而HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C几乎覆盖了ECM的全部蛋白成分，因此，上述指标能够较好地反映肝脏功能[6]。HA由间质细胞合成并在肝脏内皮细胞内代谢，当肝脏功能受损时HA在血液中蓄积，有研究显示,在肝硬化早期HA明显增加，HA>60 μg/L对肝硬化早期诊断的敏感性可达90%以上，当肝硬化缓解后，HA下降速度也最快[7]；LN的变化则直接与肝窦毛细血管的结构密切相关，当肝窦毛细血管出现充血和水肿时，LN在血清内的含量明显增加；PCⅢ是Ⅲ型胶原在体内的前体，而在肝纤维化早期Ⅲ型胶原表达明显增加；Ⅳ型胶原主要在肝内合成及代谢，是基底膜的重要组分之一，同时也是反映肝纤维化活动性和程度的重要参考指标。ALT可以反映肝细胞的完整程度，AST可以反映线粒体膜的完整程度，当肝细胞膜受损通透性增加时，酶从肝细胞内逸出进入血液，导致血内ALT和AST含量增加，因此二者是诊断肝实质损害的重要依据之一[8]。同时，本实验选取了SOD和MDA的活性来判断肝脏损伤情况。其中MDA是氧化应激常用的标志物，由多不饱和脂肪酸过氧化分解产生，是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，常用来间接反映机体的自由基代谢变化及细胞的损伤程度[9-10]；SOD广泛存在于需氧有机体中，是一种抗氧化的酶，主要功能是保护肝脏免遭氧化性损伤。

在小鼠的肝纤维化模型形成过程中，上述血清学的指标变化晚于病理改变的发生，这是由于肝脏具有很强的代偿能力，在肝脏失代偿前血清学的指标均未发生明显变化。当肝脏进入失代偿期后，小鼠肝脏发生相应的病理学改变，包括肝小叶界限不清，胞质内还可见多个大小不等的脂肪空泡；出现炎性细胞浸润，肝细胞索排列紊乱，肝窦变窄。此时血清学的指标变化逐步显现。本实验选用HE和MASSON两种指标来检测肝脏的病理变化，发现当腹腔注射CCl4后10周,小鼠的肝脏出现脂肪变性和纤维化。本研究表明，软肝冲剂低剂量组和高剂量组均能显著降低血液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量，降低肝脏组织中MDA水平，减轻过氧化反应，提高肝脏组织中SOD水平，使细胞中有足够的SOD对抗过氧化反应，清除氧自由基，保护细胞膜免受自由基的攻击。软肝冲剂低剂量组的作用效果与护肝片相似，但软肝冲剂高剂量组的效果则明显优于低剂量组和护肝片组，病理学HE和MASSON染色结果也充分证实了此结果。因此，软肝冲剂可以改善肝脏功能，此结果保护肝细胞和抑制肝纤维化。

参考文献：

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[9]马建红,贡桂英,刘吉祥,等.丹参强肝胶囊治疗慢性乙型肝炎肝纤维化54例[J].河南中医,2015,35(7):1544-1546.

[10]舒发明,龚世梅,刘业方,等.经验方治疗肝纤维化研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(1):214-216.

收稿日期：2015-12-27

基金项目：辽宁省自然科学基金(201101142)；辽宁省社会发展攻关计划(2012225018)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607006

Pathological changes in liver fibrosis model of mice and therapeutic effects of Ruangan granule

LIU You1,ZHANG Xiao-huan1,BAI Jian2,3*,ZHANG Li-ping2,WANG Xue-liang2

(1.General Hospital of PLA Hainan Branch,Sanya 572000,China;2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China;3.Institute of Organ Transplantation,the 309th Hospital of Chinese PLA,Beijng 100091,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the pathological changes of liver fibrosis model in mice and the therapeutic effect of Ruangan granule (RGG) on liver fibrosis model in mice.MethodsTotally 60 male SPF class C57B/L mice were randomly divided into five groups,including control group,model group,colchicines group,RGG low group and RGG high group,12 mice in each group.Mice in control group were injected 100% peanut oil,1 mL/kg,twice a week in totally 10 weeks;mice in model group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week in 10 weeks;mice in liver-aid tablets group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week in 10 weeks,and colchicines was used from the third week until the tenth week,0.1 mg/(kg·d);mice in RGG low group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week for 10 weeks,and RGG was used from the third week until the tenth week,1 g/(kg·d);mice in RGG high group were treated in the same way as RGG low group,but RGG was fed in 5 g/(kg·d).At the tenth week,blood samples were collected from the mice by removing eyes and the content of hyaluronic acid (HA),layer adhesion protein collagen type(LN),three former Ⅲ (PCⅢ),collagen-Ⅳ(Ⅳ-C),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum were tested.The content of super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver tissue was tested;liver index was calculated;pathological and histological changes of mice liver were observed by HE and MASSON staining.ResultsThe levels of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C,ALT and AST in serum of mice in model group were significantly increased (P<0.05) compared with those in control group;the content of SOD in liver tissue was significantly lower (P<0.05);the content of MDA in liver tissue was significantly higher (P<0.05);liver index was significantly higher (P<0.05);HE pathological examination showed that there was necrosis of liver cells,fat vacuoles,fibrous tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration;MASSON pathological examination showed that there was necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.The levels of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C,ALT and AST in serum of mice in RGG groups were significantly reduced (P<0.05) compared with those in model group;SOD in liver tissue was significantly higher (P<0.05);MDA in liver tissue was significantly lower (P<0.05);liver index significantly decreased (P<0.05);pathological examination showed that there was no inflammatory infiltrates in liver tissue of fat vacuoles or fibrous tissue deposition;MASSON pathological examination showed that there was no necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.ConclusionIntraperitoneal injection of CCl4can form cirrhosis model of mice and pathological changes are mainly necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.RGG can improve the function of liver and reduce the liver fibrosis of mice.

Key words：Ruangan granule;Liver fibrosis;SOD;MDA