红景天提取液对大鼠心肌缺血预处理的实验研究

2016-08-12 07:39刘家军李龙珠李贤玉
实用药物与临床 2016年7期
关键词:超氧化物歧化酶丙二醛预处理

刘家军,李龙珠,李贤玉



红景天提取液对大鼠心肌缺血预处理的实验研究

刘家军1,李龙珠1,李贤玉2*

1.湖北省十堰市中医医院消化科,湖北 十堰

[摘要]目的探讨红景天提取液对大鼠心肌缺血预处理后的心肌保护作用机制。方法将20只健康大鼠随机分为模型组、红景天组,两组均经尾静脉注射垂体后叶素,建立急性心肌缺血模型,红景天组尾静脉注射红景天提取液2 mL/(kg·d),模型组给予等体积生理盐水。于缺血前及缺血预处理1周后,尾静脉取血测定血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,断头取心,以ELISA法测定大鼠缺血心肌组织受体胎肝激酶1(FLK-1)蛋白及FLK-1a mRNA,缺氧诱导因子-1a(HIF-1a)蛋白及HIF-1a mRNA,缺血心肌组织中丙二醛(MDA)。结果与模型组及缺血预处理前比较,红景天组在缺血预处理1周后FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表达明显增强,CAT、SOD活性提高,MDA含量明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论红景天提取液可提高预处理后FLK-1蛋白、HIF-1a蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a mRNA表达及自由基清除酶活性,减轻急性心肌缺血大鼠血管内皮炎症反应,抑制脂质过氧化反应,对心肌缺血有一定的保护作用。

[关键词]大鼠;红景天提取液;预处理;受体;丙二醛;超氧化物歧化酶;过氧化氢酶

0 引言

红景天是主产于西藏、青海、西宁、四川等高寒地带的景天科植物大花红景天,其根茎可入药,富含红景天苷、红景天苷元、没食子酸、β-谷甾醇、二苯甲基六氢吡啶等多种有机成分[1],根茎味甘涩性寒,归脾肺经,素有“高原人参”之称[2]。已知其主要有效药理成分为红景天苷,具有抗缺氧、抗疲劳、抗寒冷、抗微波辐射,提高免疫力的作用[3]。还可增强心脑组织耐缺氧能力,在抑制缺血缺氧损伤引起的脂质过氧化、清除自由基等方面具有明显作用[4]。本实验用红景天提取液对心肌缺血大鼠进行缺血前预处理1周,观察红景天提取液对心肌缺血预处理后的心血管内皮炎症及心肌酶的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级健康Wistar大鼠20只,鼠龄45~60 d,体重(200±20)g,采用随机数字表编号随机分为模型组、红景天组,每组10只。

1.2仪器及药品BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟电子有限公司,型号:BL-420F);红景天(十堰市太和医院中药房提供生药10 g);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司,批号:061222);CAT、MDA及SOD测试盒(上海江莱生物科技有限公司,批号:KB13297);大鼠FLK-1、HIF-1a蛋白、ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,批号:mi028457)。

1.3大鼠缺血预处理及心肌缺血动物模型制备方法将红景天生药10 g加水200 mL熬制成100 mL药液,定性滤纸过滤得到60 mL红景天提取液,根据人与动物体表面积换算公式[大鼠用药剂量(mg/kg)=W(人与大鼠体表面积换算系数)×A(人用药剂量)][5],人用药10 g/d,大鼠用药量换算后可按2 mL/(kg·d)尾静脉注射,模型组注入等体积生理盐水对照,两组动物均预处理1周。1周后参照文献[6]方法造模,造模前夜不禁水,但停止喂食,造模时腹腔注射2%戊巴比妥钠(120 mg/kg)麻醉大鼠,仰卧位固定后接Ⅱ导联,用BL-420F记录Ⅱ导联心电图。然后两组动物用垂体后叶素(1.5 U/kg)经尾静脉注射后观察Ⅱ导联心电图。当心电图出现明显的ST段上移、T波高耸或(和)期前收缩等心律失常时,即说明模型复制成功。术后将动物分笼饲养,12 h交替光照,自由饮水,普通饲料喂养,房温度18~25 ℃,湿度50%~75%。

1.4检测指标及方法经眼眶静脉采预处理前后大鼠外周血,采用ELISA法测定大鼠外周血SOD、CAT酶活性,严格按MDA试剂盒说明检测心肌组织MDA[7]。动物取血完毕后断头摘取心脏,分离左心室缺血部位心肌组织,分别编号,-30 ℃低温冰箱暂存,检测时取缺血心肌组织标本研磨,3 000 r/min高速离心20 min,然后取上清液,严格按ELISA试剂盒说明操作,采用双抗体夹心ELISA法测定缺血心肌组织FLK-1蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白、HIF-1a mRNA表达。

2 结果

2.1红景天提取液对大鼠外周血SOD、CAT及心肌MDA的影响两组大鼠外周血SOD、CAT及心肌MDA在缺血预处理前差异无统计学意义(P>0.05);模型组缺血预处理1 周时,血清SOD、CAT水平明显降低,心肌MDA增高,与缺血预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。红景天组SOD、CAT含量明显增高,MDA降低,与预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示红景天提取液具有促进SOD、CAT释放及增强组织对自由基清除活性、抑制脂质过氧化反应的作用。见表1。

表1 大鼠心肌缺血预处理前后SOD、MDA及CAT水平比较

注:与预处理前比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

2.2红景天提取液对大鼠FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表达的影响两组大鼠缺血预处理前FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。在缺血预处理1周后,模型组FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA表达增强,与缺血预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。红景天组FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA阳性表达较模型组均明显增强,与模型组及本组预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3红景天提取液对大鼠HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表达的影响两组大鼠缺血预处理前HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA阳性表达差异无统计学意义(P>0.05)。模型组在缺血预处理1周后,HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表达呈升高趋势,与本组预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示大鼠心肌缺血与HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表达密切相关;红景天组HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA比模型组增加更明显,与模型组及本组预处理前比较,差异有统计学意义(P<0.05),提示红景天提取液具有显著提高HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA表达的作用。见表3。

3 讨论

机体在正常情况下,氧自由基的生成与清除维持动态平衡,血管内皮及其功能保持完整性,当有心、脑、肾等组织器官创伤缺血梗阻后,由于某种原因(如手术或药物治疗)造成血液再通时,伴随组织器官缺血再灌注会产生大量的氧自由基,氧自由基会造成脂质过氧化反应,此时机体SOD、CAT等自由基清除酶活性急剧降低,造成自由基清除酶对氧自由基清除能力下降,MDA等代谢产物会大量产生,导致心肌等组织器官血管内皮细胞严重受损[8]。故MDA、SOD、CAT等在心肌细胞损伤或坏死时的含量变化可间接反映细胞受自由基损伤的程度。心脏支架、冠脉搭桥术、心肌梗死再通术、冠脉溶栓术等方法治疗心肌梗死时,有可能引起心肌缺血/再灌注损伤而造成不良事件发生[9],为避免这种严重后果,采用药物进行缺血预处理不失为一种补救方法。近年来研究发现,红景天的主要成分红景天苷能增加缺血受损血管内皮细胞分泌VEGF,而FLK-1蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a蛋白、HIF-1a mRNA表达与VEGF的血管炎症反应和血管再生密切相关,且红景天苷具有明显的抑制脂质过氧化反应[10-11],还可扩张冠状动脉,增加冠状动脉供血,解除冠状动脉痉挛,对心肌缺血/再灌注损伤具有保护作用[12]。但由于其对心肌缺血预处理的机制鲜有系统的实验报道,故本实验采用红景天提取液对大鼠进行1周的缺血预处理,观察了其对心肌SOD等酶学及血管炎症反应的影响,探讨其作用机制,为其临床治疗及预防心肌缺血/再灌注损伤提供实验及理论依据。

表2 大鼠心肌缺血预处理前后FLK-1a蛋白及FLK-1 mRNA表达比较

注:与预处理前比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

表3 大鼠心肌缺血预处理前后HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA阳性表达比较

注:与预处理前比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

本研究发现,模型组大鼠在进行缺血预处理1周后,其HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA、FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA的阳性表达均有不同程度增强,说明心肌缺血、缺氧可诱导其增殖,减轻心肌血管内皮受损的程度。红景天组缺血预处理1周后,HIF-1a蛋白及HIF-1a mRNA、FLK-1蛋白及FLK-1 mRNA的阳性表达较模型组明显增强,这可能是因为红景天提取液具有扩张冠脉、诱导缺血心肌组织的血管再生、促进缺血心肌组织侧支循环建立而改善微循环、增加冠脉灌注和心肌供氧的作用,这也是红景天活血化瘀的药性特性之一。有研究认为,红景天可促进机体Ca2+-ATP酶活性的恢复,增强Na+-K+-ATP酶活力,减少心肌血管Ca2+内流,避免细胞内钙超载造成血管痉挛,并通过Na+-K+-ATP调节Na+-H+交换来抑制Na-Ca2+交换,扩张冠脉,改善缺血心肌组织供氧[13],进而改善心肌缺血而起到保护作用[14]。亦有文献报道,红景天提取液具有改善缺血心肌组织的能量代谢,改善病灶缺血、水肿,促进细胞功能恢复,减轻缺血再灌注后组织损伤而起到保护心血管系统的作用[15-16]。同时,实验证实,红景天还能提高CAT、SOD活性,降低MDA含量,这也说明红景天提取液可抑制脂质过氧化反应而达到保护缺血心肌的作用。

综上所述,缺血预处理在临床防治缺血性疾病尤其缺血/再灌注损伤中有重要的临床意义,积极寻找减轻或降低心肌缺血/再灌注损伤的药物意义重大。本实验证实,红景天提取液具有提高CAT、SOD自由基清除酶活性,抑制脂质过氧化反应,诱导FLK-1蛋白、HIF-1a蛋白、FLK-1 mRNA、HIF-1a mRNA表达,减轻急性心肌缺血大鼠血管内皮炎症反应的作用。在治疗心肌缺血预处理上有广泛的应用前景,但心肌缺血/再灌注损伤机制是一个多因素参与的复杂生理过程,红景天提取液如何在缺血预处理各个环节中发挥调节和干预作用,阻断心肌缺血/再灌注损伤的发生,还有待于医学科研工作者深入研究。

参考文献:

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收稿日期:2015-11-30

基金项目:湖北医药学院研究生启动基金(2008QDJ9)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607005

Study on rhodiola liquor in myocardial ischemia preconditioning in rats

LIU Jia-jun1,LI Long-zhu1,LI Xian-yu2*

(1.Department of Digestion,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442012,China;2.Hubei University of Medicine,Shiyan 442012,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective mechanism of rhodiola liquor in myocardial ischemic preconditioning in rats.MethodsTwenty healthy rats were randomly divided into model group and rhodiola group.The acute myocardial ischemia model was established with injection of posterior pituitary hormone through caudal vein.The rhodiola group was injected with rhodiola liquor [2 mL/(kg·d)] and the model group with saline [2 mL/(kg·d)) through caudal vein.The blood was gathered before heart ischemia and one week after heart ischemia.The protein and mRNA were extracted from myocardium.The activity of SOD and CAT was measured.The expression of HIF-1a,FLK-1,HIF-1a mRNA,FLK-1 mRNA and MDA was measured.ResultsCompared with the model group and the rhodiola group before myocardial ischemic preconditioning,the expression of FLK-1,FLK-1 mRNA,HIF and HIF-1a mRNA were significantly increased in the rhodiola group.The activity of SOD and CAT was significantly enhanced.However,the content of MDA was significantly decreased (P<0.05).ConclusionThe rhodiola liquor can increase the activity of free radical eliminate enzyme,FLK-1 protein,and HIF-1a protein,increase the expression of FLK-1 mRNA and HIF-1a mRNA,reduce acute inflammation reaction of vascular endothelium,and inhibit the lipid peroxidation,and it has protective effect on myocardial ischemia.

Key words:Rat;Rhodiola liquor;Pretreatment;Receptor;MDA;Superoxide dismutase;Catalase

442012;2.湖北医药学院,湖北 十堰 442012

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