淀粉类酶降解烤烟中淀粉的研究

罗　丹，吴　俊，全学军，戴　亚，马扩彦

(1.重庆理工大学 化学化工学院，重庆　400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆　400062)



淀粉类酶降解烤烟中淀粉的研究

罗丹1，吴俊1，全学军1，戴亚2，马扩彦2

(1.重庆理工大学 化学化工学院，重庆400054；2.重庆中烟工业有限责任公司，重庆400062)

摘要：以云烟85为原料，为降低烤烟中淀粉含量，研究了外加α-淀粉酶和糖化酶对淀粉降解的影响。结果表明：外加淀粉类酶能有效降低烤烟中的淀粉含量。未处理前云烟85直链淀粉含量约为1.42%，支链淀粉约为2.67%。淀粉类酶混合液处理8 h后，直链淀粉减少了约34.5%，支链淀粉减少了约66.7%。采用扫描电镜对原样、缓冲液处理样品以及淀粉类酶处理样品进行了观察分析，结果表明：酶处理前后烟叶组织结构有较大变化，酶处理之后烟叶组织结构由于淀粉降解而出现塌陷现象，从而呈现大面积的凹凸不平区域。

关键词：烟草;淀粉；淀粉类酶；表面微结构

淀粉是烟草生长过程中积累的重要碳水化合物，广泛存在于烟草的茎叶中。新鲜烟叶经过调制，大部分淀粉降解为还原糖，但处理后的烟叶仍残留一定量的淀粉。一些研究表明[1-3]：烟叶中淀粉含量较高将会影响燃吸速度，产生较多有害成分，对烟草的色、香、味产生不良影响。近年来，我国烤烟水平不断提高，但与进口烟相比在其内在的化学组成协调性等方面还存在着较大差异。目前，我国烤烟中淀粉含量(质量分数)约为4%～6%，而国外优质烤烟淀粉含量仅为1%～2%[4]。因此，进一步研究降解烤烟中的淀粉，对提高我国烟草产品品质具有重要的意义。

近年来，利用外加酶制剂降低烟叶中的淀粉，以提高烟叶的品质已成为烟叶发酵研究的热点。烟草在烘烤过程中外加淀粉类酶能有效降解烟草中淀粉，向烤后烟叶中加入一定量的糖化酶和α-淀粉酶，能有效将淀粉降解为水溶性糖[5-7]。然而，大多数研究只考察了糖化酶和α-淀粉酶对烟草总淀粉的降解情况，而没有对糖化酶和α-淀粉酶处理之后的烟叶中淀粉组成以及烟草组织结构的变化情况进行研究。本研究采用高氯酸超声提取淀粉[8]结合双波长法[9-10]测定了淀粉类酶处理前后烟叶中直链淀粉和支链淀粉含量，并考察了淀粉类酶处理前后烟叶组织结构的变化情况。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

云烟85烤烟叶C3F， 2012年产于四川凉山州西昌市，由重庆中烟工业有限责任公司提供；直链淀粉和支链淀粉标准样品，美国Sigma公司出品；α-淀粉酶(活力为30μg/mg)和糖化酶(活力为120μg/mg)，美国Sigma公司出品；无水乙醇、氯化钠、高氯酸、氢氧化钠、碘、碘化钾，成都市科龙化工试剂厂生产。

电子分析天平，感量为0.000 1g，梅特勒-托利多仪器上海有限公司出品；超声清洗器(KQ-400KDE)，昆山市超声仪器有限公司生产；精密酸度计(pH-3S)，南京桑力电子厂生产；双光束紫外可见分光光度计(TU-1901)，北京普析通用仪器有限责任公司生产；扫描电镜(JSM-6460LV)，日本电子株式会社生产。

1.2方法

1.2.1样品预处理

配制NaH2PO4·2H2O缓冲溶液，添加70mg/L的Ca2+浓度，调节pH值至5.45。加入淀粉类酶，配制成12μg/mL的a-淀粉酶溶液和48μg/mL糖化酶溶液[11-12]。以烟叶质量为基准，加入量为α-淀粉酶15μg/g、糖化酶150μg/g，在55℃恒温水浴锅中恒温一定时间，取处理之后烟叶清水冲洗，40 ℃烘干，再进行淀粉含量测定及电镜扫描。

1.2.2淀粉含量测定方法

实验流程：烟草粉粹→过筛(40～100目)→除杂(饱和NaCl-乙醇溶液)→过滤(取滤渣)→提取(高氯酸溶液)→过滤(取滤液、淀粉提取液)→显色反应(I2/KI溶液)→测吸光度。最后根据对应波长所测定的吸光度计算支链淀粉和直链淀粉的提取率。

配制直链淀粉标准液：称取直链淀粉纯品0.100 0g，置于100mL烧杯中，加入5mL1mol/LNaOH溶液，待溶解后转移到容量瓶中，加蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mL直链淀粉标准溶液。

配置支链淀粉标准液：用0.100 0g支链淀粉按上述方法制备成1mg/mL支链淀粉标准溶液。

取0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5mL(1mg/mL) 直链淀粉贮备溶液，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0和4.5mL(1mg/mL)支链淀粉贮备溶液，分别加入到50mL容量瓶中，加入蒸馏水30mL稀释，将1.5mL高氯酸溶液(质量分数为45%)、氢氧化钠溶液(2.5mol/L)调节pH值至3.5左右，加0.6mLKI(0.2gI2/2g)溶液，用蒸馏水定容至刻度，在室温下显色15min。以蒸馏水作空白，选定波长检测其吸光度。

1.2.3烟叶组织结构观察

采用日本JSM-6460LV扫描电镜，将酶处理前后的处理烟叶平铺于载样台上，按照常规方法喷金处理。喷金后样品直接放入扫描显微样品室进行观察。扫描中采用5.00kV的加速电压。

2　结果与讨论

2.1直链和支链淀粉的测定方法

用TU-1901双光束紫外可见分光光度计对直链淀粉和支链淀粉扫描，扫描光谱如图1所示。根据双波长法原理，选定波长具备2个特征：一是待测组分在选择的测定波长上的吸光度差值较大；二是共存组分在测定波长应具有相同的吸收值，使其浓度变化不影响测定结果[13]。直链淀粉测定波长为510nm和590nm，支链淀粉测定波长为550nm和702nm。

图1　支链淀粉和直链淀粉测定参比波长

直链淀粉标准曲线：根据双波长原理在波长510nm和590nm测定吸光度值，以直链淀粉含量为横坐标，ΔA=(A590nm-A510nm)为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。得直链淀粉回归方程为：Y1=0.008 22X1+0.010 29，R2=0.996 9。在(5～30)mg/L线性良好。

支链淀粉标准曲线：在波长550nm和702nm测定吸光度值，以支链淀粉含量为横坐标，ΔA=(A550nm-A702nm)为纵坐标，绘制标准曲线，如图3所示。得到支链淀粉回归方程为：Y2=0.002 65X2+0.008 19，R2=0.995。在40～90mg/L线性良好。

图2　直链淀粉标准曲线

图3　支链淀粉标准曲线

2.2酶处理前后淀粉含量分析

按照以上建立的标准曲线，采用双波长法测定烤烟原样以及酶处理之后烟叶中淀粉含量，检测结果如表1所示。未经过任何处理的云烟85烤后烟叶中直链淀粉含量约为1.42%，支链淀粉约为2.67%。烟叶经过α-淀粉酶和糖化酶混合溶液，在55 ℃水浴锅中浸泡降解8h后，直链淀粉和支链淀粉均有减少，其中直链淀粉减少了约34.5%，支链淀粉减少了约66.7%。这可能是因为支链淀粉在酶解过程中整个侧链断开而形成新的直链淀粉[14]，因此在整个酶解过程中支链淀粉的降解速度更快。采用双光束紫外可见分光光度计(TU-1901)对淀粉类酶处理烟叶的淀粉提取液与KI(0.2gI2/2g)溶液的显色溶液进行光谱扫描，结果如图4所示。由吸收光谱可以看出：相同质量烟叶酶处理前的吸收峰明显高于酶处理之后的吸收峰，这表明α-淀粉酶和糖化酶对烤烟中的淀粉的降解有较好的效果。此外，酶处理后的最大吸收峰波长由处理前的591nm移向603nm，这主要因为云烟85酶处理前淀粉支链含量∶直链含量为1.88∶1，酶处理之后为1∶1.05，而直链淀粉的最大吸收峰为620nm，支链淀粉的最大吸收峰为560nm[15]，因此酶降解处理之后的淀粉提取液与KI(0.2gI2/2g)溶液显色的最大吸收峰波长向高波长(直链淀粉最大吸收峰波长)移动。

表1　烤烟中酶处理前后淀粉含量

图4　酶处理前后淀粉测定的吸收光谱图

2.3烟叶组织结构变化情况分析

图5分别为云烟85原样、缓冲液处理样品以及酶处理样品的扫描电镜图。由图5(a)、(b)可以看出：未经过缓冲液和酶液处理烤烟呈现出大量不规则、表面光滑的编织状沟槽纹理结构[16]。图5(c)、(d)为缓冲液浸泡处理8h后的烟叶组织电镜图，对比缓冲液处理前后，处理之后烟叶表面光滑凸起结构消失，变成扁平状结构，裸露出少量纤维痕迹。这主要因为烤烟经过缓冲液浸泡以及清水的冲洗使组织中部分水溶性物质溶解流失，从而导致原有凸起结构发生变化形成扁平状。图5(e)、(f)为云烟85在α-淀粉酶15μg/g和糖化酶150μg/g混合液中浸泡处理8h后的烟叶组织扫描电镜图。酶液处理后的烟叶组织结构和原样结构相比，表面光滑的编织状沟槽纹理结构几乎全部消失，与缓冲液浸泡处理烤烟结构相比扁平区域出现严重的凹凸不平现象，且呈现出更多的纤维线状结构。这可能因为淀粉类酶的加入使烟叶中部分淀粉降解转化成水溶性糖类溶解流失[17-18]，从而使原有的淀粉组织部位出现塌陷现象，形成大量杂乱凹凸不平区域。

3　结束语

本研究用α-淀粉酶和糖化酶处理云烟85烤后烟叶，对处理前后烟叶的淀粉含量以及烟叶的组织结构变化情况进行了研究。结果表明：α-淀粉酶和糖化酶处理云烟85，使直链淀粉减少约34.5%，支链淀粉减少约66.7%。淀粉类酶溶液对烟叶组织结构也有较大的影响；未经处理的烟叶组织呈现出大量不规则的、表面光滑的沟槽纹理结构，而经过淀粉类酶液处理之后的烟叶表面光滑的沟槽纹理结构几乎全部消失，且在淀粉降解部位出现塌陷现象，有大面积凹凸不平区域。烟草中淀粉的减少与组织结构的变化对于烟草制品品质的提高应该具有较好的改善作用。

图5　云烟85组织结构电镜扫描图

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(责任编辑刘舸)

收稿日期：2016-05-16

基金项目：重庆中烟工业有限责任公司科技项目“烟草中淀粉的存在形态及其分析方法研究”(hx201314)

作者简介：罗丹(1989—)，女，重庆人，硕士研究生，主要从事材料化学研究。

doi:10.3969/j.issn.1674-8425(z).2016.07.011

中图分类号：TS411.1

文献标识码：A

文章编号：1674-8425(2016)07-0064-05

EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves

LUODan1，WUJun1，QUANXue-jun1，DAIYa2，MAKuo-yan2

(1.CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ChongqingUniveristyofTechnology,Chongqing400054,China；2.ChinaTobaccoChongqingIndustrialCo.,Ltd.,

Chongqing400062,China)

Abstract:The effects of amylases on the degradation of starch in flue-cured tobacco leaves were investigated using Yunyan 85 as the raw material in order to reduce the content of starch in flue-cured tobacco leaves. Results show that applying amylases to degrade starch in flue-cured tobaccos leaves was effective. Before treatment, the amylose and amylopectin contents in Yunyan 85 are 1.42% and 2.67% respectively. After 8 h treatment of flue-cured tobaccos leaves, the amylose and amylopectin contents in the sample leaves were decreased by about 34.5% and 66.7%, respectively. Scanning electron microscopy (SEM) observation showed that amylase treatment caused greater changes in the texture of the flue-cured tobacco leaves, and the original smooth surface was turned into rugged surface with obvious cellulose substance.

Key words：tobacco; starch; amylases；surface micro-structure

引用格式：罗丹，吴俊，全学军，等.淀粉类酶降解烤烟中淀粉的研究[J].重庆理工大学学报(自然科学)，2016(7):64-68.

Citationformat：LUODan，WUJun，QUANXue-jun,etal.EffectsofAmylasesonDegradationofStarchinFlue-CuredTobaccoLeaves[J].JournalofChongqingUniversityofTechnology(NaturalScience)，2016(7):64-68.