消岩汤对A549/DDP细胞自噬及耐药蛋白的影响研究*

杨佩颖，许文婷，刘宏根，张　欣，张　莹，于晓宇，贾英杰

（天津中医药大学第一附属医院，天津　300193）

消岩汤对A549/DDP细胞自噬及耐药蛋白的影响研究*

杨佩颖，许文婷，刘宏根，张欣，张莹，于晓宇，贾英杰

（天津中医药大学第一附属医院，天津300193）

［目的］通过消岩汤对耐顺铂人肺腺癌细胞A549/DDP多药耐药及自噬蛋白的影响，探究消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP的耐药逆转作用及探讨相关分子通路。［方法］建立稳定细胞耐药模型，连续灌胃不同浓度消岩汤10 d后，通过血清药理学的实验方法，提取药物血清，用含药血清作用于肺腺癌细胞耐药细胞A549/DDP，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（QPT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Werstern Blot）检测A549/DDP耐药、自噬相关基因的表达及相关通路蛋白的变化。［结果］高剂量消岩汤，低剂量消岩汤和生理盐水作用于肺腺癌耐药细胞A549/DDP，检测A549/DDP细胞中耐药相关蛋白P-糖蛋白（P-gp）、肺抗药性相关蛋白（LRP）及自噬相关蛋白Beclin1，HMGB1 mRNA和蛋白表达变化，发现高剂量组消岩汤处理细胞株后P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1，HMGB1 mRNA和蛋白均发生降低（P＜0.05），进一步发现消岩汤可影响AKT1-mTOR相关基因，消岩汤明显降低AKT1，mTOR蛋白的表达。［结论］消岩汤通过影响AKT1-mTOR分子通路进而影响耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1，HMGB1基因的变化。

消岩汤；细胞自噬；耐药；分子通路

化疗在恶性肿瘤综合治疗中有举足轻重的地位，据美国癌症协会估计，90%以上肿瘤患者死亡在不同程度上受到耐药的影响。在恶性肿瘤的治疗过程中，肿瘤患者对化疗药物的耐药性成为肿瘤治疗的最大瓶颈之一。有些肿瘤，在治疗开始时就会出现对药物的高度耐受，另一些肿瘤，化疗开始时有效，久用则产生抗药，如小细胞肺癌等，出现获得性抗药性（Acquired resistance）称为继发性耐药［1］。化疗过程中产生耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因，因此克服多药耐药性是治疗肿瘤不可回避的问题［2］。肿瘤细胞对化疗药物的耐药性与肿瘤的发生一样，是一个多因素、多步骤的过程。目前研究耐药机制较为广泛的是P-糖蛋白（P-gp）外排，大多数研究认为化疗药物在体内作用减少主要是因为药物在细胞内流减少，或者由于外排增多，其中P-gp、肺抗药性相关蛋白（LRP）是细胞膜的转运蛋白，肿瘤药物可以通过细胞膜的转运蛋白使外排增多，从而减少药物在细胞中浓度。目前大量研究显示，细胞自噬的变化也可导致细胞耐药性的改变。自噬在肿瘤发生发展中的作用是复杂的，是肿瘤治疗的双刃剑。化疗药物处理的肿瘤细胞可以发生死亡性自噬和保护性自噬［3］。多种抗肿瘤治疗后，因肿瘤缺氧，一定程度上削弱了抗肿瘤治疗的效果，从而产生耐药［4］。大量实验证明，通过抑制细胞自噬，使肿瘤患者对抗癌药物和放疗的敏感性增加。有学者发现通过抑制核糖核酸（RNA）干扰自噬相关基因的表达可上调自噬表达，从而逆转乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性［5］。张洁等［6］发现对顺铂耐药的A2780/DDP细胞中，下调自噬基因Beclin 1的表达对顺铂诱导的自噬激活具有抑制作用，提高了耐顺铂细胞的敏感性。在此基础上，笔者将消岩汤分为低剂量组和高剂量组，并且与生理盐水组相比较，分析消岩汤对耐药基因和自噬基因的影响，并探索其分子机制。

1　材料与方法

1.1细胞人肺腺癌A549敏感细胞（由天津医科大学基础实验中心提供），A549/DDP耐药细胞（购于上海博谷生物科技有限公司：博谷公司采用恒定的顺铂浓度，周期性的作用于人肺腺癌A549敏感细胞，经过6个月的诱导，培育而成的耐顺铂人肺腺癌A549/DDP耐药细胞）。

*基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273937），天津市科委自然科学基金青年项目（13JCQNJC10900），天津市抗癌重大专项攻关计划（12ZCDZSY15800）。

作者简介：杨佩颖（1982-），女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合肿瘤治疗工作。

通讯作者：贾英杰，E-mail：jiayingjie1616@sina.com。

1.2试剂、耗材及仪器Mini-PROTEAN 3 Elecreophoresis Cell、Mini Trans-Blot Module、PowerPac Basic Power Supply均来自Bio-Rad，FluorChem FC2 Imaging System、AlphaView系统软件均来自Alpha Innotech。0.02%EDTA的配制、MTT溶液的配制，PVDF膜，辣根酶标记二抗，ECL。

1.3A549裸鼠皮下移植瘤模型的建立A549细胞培养、传代：采用人肺腺癌细胞系A549。耐DDP肺腺癌细胞系A549/DDP模型进行培养并传代，在细胞的对数生长期收集细胞。离心5 min，磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤两次，离心后弃上清液，离心管外周以冰袋来维持温度在4℃左右，以此来保持瘤细胞的活性。最后用生理盐水稀释，把细胞浓度调整到5×106cell/mL。在高剂量组、低剂量组、生理盐水组中每只小鼠右前腋下皮下接种0.2 mL。

1.4消岩汤含药血清干预A549/DDP耐药细胞1）制备消岩汤：方由黄芪、太子参、夏枯草、白花蛇舌草等药物组成，规格每瓶100 mL。生产单位：本院制剂室。制备方法参照中药药物实验方法学。消岩汤（太子参、生黄芪、姜黄、郁金、白花蛇舌草等共计140 g中药）水煎液均由天津中医药大学中药提取室严格按回流提取法进行提取，其终质量浓度浓缩成每毫升相当于原生药材1.5 g的药液。2）中药灌胃：裸鼠接种A549肿瘤细胞7 d后，前3组小鼠右腋注射局部出现明显皮丘，移植瘤模型建立。待前3组所有裸小鼠的皮下肿瘤的平均直径达到约5 mm时开始消岩汤灌胃，高剂量组40 g/kg灌胃，低剂量组20 g/kg灌胃给药，连续10 d，每日1次。3）含药血清的制备：灌胃10d后眼眶取血法采血，37℃，无菌室内静置4 h，离心8 000 r/min，15 min，取淡蓝色血清于2 mL EP管中，标识组别。高速离心14 000 r/min，5 min，重复2次。分别提取上清液，分装，56℃水浴灭活30 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存。4）实验分组：生理盐水组，低浓度消岩汤组，高浓度消岩汤组干预肺癌耐药细胞株A549/DDP，72 h以后，检测肺癌耐药细胞株A549/DDP相关mRNA和蛋白的表达。

1.5检测指标

1.5.1逆转录聚合酶链反应（PCR）检测相关mRNA的表达总RNA提取试剂盒、DNA第一链合成试剂盒均购自北京通瑞生物有限公司。RNA完整性采用琼脂糖凝胶电泳检测，其透过率与纯度采用紫外分光光度计检测。以Oligo-dT15为引物，参照20 μL反应体系合成cDNA第一链。引物序列由北京通瑞生物有限公司合成并提供。反应条件为95℃预变性10 s；95℃5 s，64℃34 s，40个循环。每对引物设3个复孔。结果用ABIPRISM7500分析，融解曲线特异。无引物二聚体和非特异性扩增。ABI PRISM 7500自动生成CT值。引物：P-gp forward（5＇-AAACACCACGGGA GCA-3＇），reverse（5＇-AGTGTTAGTTGCCAGCCAT-3＇）；LRP forward（5＇-TTCTGGATTTGGTGGACGC-3＇），reverse（5＇-ACTTCTCTCCCTTGACCAC-3＇）；Beclin1forward（5＇-ATCCTCGACCGTGTCACCATCC ACG-3＇），reverse（5＇-GATGAGCTGAGTGTCCAGCTGGG-3＇）；HMGB1 forward（5＇-ATGCGCAAAGGA GATCCTA-3＇），reverse（5＇-ATTCATCATCATCTTC T-3＇）；β-actin forward（5＇-ATTCAACGGCACAGTCA AGG-3＇），reverse（5＇-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3＇）。

1.5.2用蛋白免疫印迹法（Western Blot法）检测相关蛋白表达样品处理：组织样品加适量预冷的蛋白裂解液RIPA，匀浆，14 000 r/min离心15 min，上清液转入新管。BCA法定测定蛋白含量。将蛋白质混合样品SDS-PAGE电泳：取100 μg处理好的样品，按《分子克隆》方法进行SDS-PAGE电泳，积层胶6%，分离胶8%，胶厚0.75 mm。湿法转膜：胶于转移液（含甲醇15%）中平衡10 min；从下至上分别放置滤纸、胶、PVDF膜（0.45 μm）、滤纸，夹子夹好放入倒好转移液的转移槽中，250 mA转膜90 min。转印后，将NC膜或PVDF膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检蛋白结合，再用酶标第二抗体孵育膜，使第二抗体与第一抗体结合反应，最后用酶的显色底物或发光底物显示靶蛋白条带。

1.6统计学分析采用SPSS 22统计软件处理，实验数据用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett's T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 PCR检测A549/DDP细胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表达A549/DDP细胞在盐水，低剂量消岩汤，高剂量消岩汤72 h后收集细胞提取总RNA，PCR检测与P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 mRNA表达量的变化，实验重复3次。结果表明：与生理盐水组，随着消岩汤含药血清药物浓度的增加，P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1 mRNA表达逐渐减弱，并且差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1PCR检测A549/DDP细胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表达（±s）Tab.1 PCR detection of A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 expression（±s）

表1PCR检测A549/DDP细胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1的表达（±s）Tab.1 PCR detection of A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 expression（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05。

组别　P-gp　LRP　Beclin1　HMGB1生理盐水组　0.40±0.05*0.42±0.04*0.54±0.05*0.59±0.07*低剂量消岩汤组　0.23±0.04*0.21±0.02*0.24±0.04*0.38±0.04*高剂量消岩汤组　0.08±0.01*0.11±0.01*0.07±0.01*　0.09±0.10*

2.2Western Blot法检测 A549/DDP细胞 P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白的表达A549/DDP细胞在盐水，低剂量消岩汤，高剂量消岩汤72 h后收集细胞提取总蛋白，Western blot检测与自噬、耐药相关的P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白表达量的变化。结果表明：与生理盐水组比较，随着消岩汤药物浓度的增加，P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白表达逐渐减弱，并且差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1　Western Blot法检测A549/DDP细胞P-gp、LRP、Beclin1、HMGB1蛋白的表达Fig.1　Western Blot method to detect the A549/DDP cell P-gp，LRP，Beclin1，HMGB1 protein expression

2.3Western Blot法检测 A549/DDP细胞检测AKT1-mTOR分子通路蛋白A549/DDP细胞在生理盐水，低剂量消岩汤，高剂量消岩汤72 h后收集细胞提取收集细胞提取总蛋白，Western blot检测与细胞自噬相关的AKT1，mTOR的表达变化，实验重复3次。结果表明：与生理盐水组比较，随着消岩汤药物剂量的增加，AKT1，mTOR蛋白表达逐渐减弱，并且差异有统计学差异（P＜0.05）。见图2。

图2Western Blot法检测A549/DDP细胞AKT1-mTOR分子通路蛋白Fig.2　Western Blot method to detect the A549/DDP cells AKT1-mTOR molecular pathways protein

3　结论

不同浓度的消岩汤作用于肺腺癌耐药细胞A549/DDP，随着中药浓度的增加，细胞耐药相关蛋白P-gp、LRP蛋白表达逐渐减弱（P＜0.05），消岩汤能下调自噬相关蛋白Beclin1、HMGB1表达，从而抑制自噬发生。进一步发现消岩汤可影响AKT1-mTOR通路相关基因变化，笔者推测消岩汤可能通过影响AKT1-mTOR分子通路进而影响耐药相关蛋白P-gp、LRP及自噬相关蛋白Beclin1，HMGB1基因的变化。

4　讨论

在肿瘤化疗过程中，大多数患者都会产生不同程度的肿瘤耐药性，影响治疗效果，降低患者的生存率及临床获益。因此，越来越多的国内外关注肿瘤耐药性的发生机制及其治疗策略。目前逆转肿瘤耐药性的研究已经取得了一定的成果，但由于大多数逆转剂的毒副反应限制在临床中的严格使用。中医药立足于辨证论治，以低毒、多靶点等优势在逆转肿瘤多药耐药性方面取得了可喜的成绩，能明显提高肿瘤对化疗药物敏感性。有研究通过观察补肾化瘀解毒复方荷瘤动物含药血清对肺腺癌敏感细胞和耐药细胞细胞毒作用，以及对细胞周期的影响和对顺铂的耐药逆转作用，结果发现补肾化瘀解毒复方使肺癌耐药细胞MRP和GST的表达下调，增强TOPOⅡ含量及其活性，并进一步研究发现，此复方有阻止肺癌耐药细胞内钙离子（Ca2+）的内流或释放作用［8］，证明中药复方联合化疗可以起到增效减毒的作用，为逆转肺癌化疗耐药性提供客观的实验依据［9］。

肿瘤的多药耐药机制十分复杂，主要与P-gp所介导的经典机制以及LRP等介导的非经典机制密切相关。Levatic J等［10］研究发现Akt介导的耐药性可能与作用于MDR1进而促进P-gp的表达相关，在肿瘤细胞内，P-gp通过利用ATP提供的能量降低细胞内药物的浓度从而使细胞产生耐药性。LRP系构成人体穹隆蛋白的主要成分，广泛分布于人体的体腔上皮、巨噬细胞、血脑屏障和分泌性器官中［11］，通过降低核内药物浓度，消除药物对脱氧核糖核酸（DNA）靶点的影响，介导对铂类、烷化剂等的耐药。有研究表明LRP在肺腺癌中的表达明显高于癌周组织［12］。这两种耐药基因产物在肺癌耐药研究中较多，其过度表达可产生耐药现象。本研究消岩汤干预耐药细胞株A549/DDP后，发现LRP和P-gp mRNA和蛋白水平均发生变化，并且发现随着浓度增加，LRP和P-gp表达越低，并且差异有统计学意义。表明消岩汤可以逆转肺癌对顺铂的耐药，分析原因认为通过抑制细胞膜上P-gp蛋白组织对化疗药物的外排和抑制LRP及其基因的表达与转录，增强了以细胞核为靶点的化疗药物进入核内，从而达到有效的药物浓度而成功逆转肺癌的耐药。

Beclin1是自噬启动过程的标志［13］，具有独特结构序列的多功能蛋白，对凋亡和自噬都有一定的调节作用，因此抑制耐药细胞Beclin 1的表达可能影响凋亡与细胞自噬的发生［14］。肿瘤细胞为了缓解化疗应激状态而存活下来，必须通过自噬及时将积聚在内质网腔内的错误折叠蛋白清除，这是肿瘤产生化疗耐药性的一种重要机制［15］。刘郁鹏等［16］研究发现新辅助多西他赛和顺铂方案术前化疗，可影响肺腺癌组织中Beclin1的表达水平，RT-PCR法检测结果显示经新辅助化疗后Beclin1 mRNA水平明显高于对照组，而Bcl-2水平明显低于对照组，Beclin1与Bcl-2呈负相关。诸多学者发现细胞自噬与肺癌化疗产生耐受相关，通过上调自噬相关基因如Beclin1，下调凋亡分子，如Caspase-3水平，使细胞耐受化疗，从而逃避凋亡而存活［17］。本研究消岩汤处理A549/DDP，发现自噬相关蛋白Beclin1，高迁移率族蛋白B-1 （HMGB1）呈药物依赖性表达下调，Beclin1通过与classⅢPI3K通路形成复合物参与自噬体的形成，Beclin1表达下降，影响自噬小体形成，无法启动自噬。Beclin1高表达增强自噬的活性，减少顺铂损伤肿瘤细胞的作用，从而发挥肿瘤保护作用，因此，抑制Belin1的表达可逆转细胞耐药，促进细胞凋亡。

消岩汤具有扶正、解毒、祛瘀之功效，黄芪、太子参滋阴益气、扶正以祛邪共为君药。夏枯草、生牡蛎、白花蛇舌草相伍清热解毒、软坚散结，为臣药。郁金、姜黄行气解郁、活血祛瘀，为佐药；蜂房搜剔络脉中之瘀毒，为使药。消岩汤君药黄芪的有效成分黄芪多糖能够逆转H22/ADM细胞株的耐药，其机制是降低了P-gp的外排功能，下调了MDRlmRNA 和P-gp的表达。AKT1-mTOR分子通路是影响细胞增殖，耐药和自噬的相关分子通路，许多研究证明AKT1-mTOR分子通路的激活与癌症的发生发展密切相关［18］。并且有研究证实姜黄素抑制肿瘤与AKT1-mTOR分子通路密切相关，通过抑制AKT1-mTOR分子通路的表达，进而降低下游基因的表达，可显著增强化疗药物的杀伤作用［19］。笔者前期发现消岩汤逆转肺癌耐药的可能机制为通过抑制P-gP及其基因的表达而阻止细胞对顺铂的输出，从而达到有效逆转肺癌耐药的疗效［20］，本研究为进一步探究中药复方消岩汤对耐顺铂人肺腺癌A549/DDP的耐药逆转作用及探讨相关分子通路。笔者研究发现，在耐药细胞株中消岩汤可以抑制AKT1和mTOR基因的表达，进而抑制AKT1-mTOR分子通路的表达，导致肿瘤细胞的死亡，而消岩汤是否直接通过抑制AKT1-mTOR分子通路导致耐药基因和自噬基因的变化，仍需进一步实验证明。

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（本文编辑：马英，高杉）

Study on the autophagy and resistance protein affected by Xiaoyan decoction in A549/DDP cells

YANG Pei-ying，XU Wen-ting，LIU Hong-gen，ZHANG Xin，ZHANG Ying，YU Xiao-yu，JIA Ying-jie
（The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Through the cisplatin resistance of the human lung adenocarcinoma cells A549/DDP multi-resistant and influence of autophagy protein by Xiaoyan decoction，finding out the influence of elimination of cisplatin resistance of lung adenocarcinoma A549/DDP resistance reversal agents and explore relevant molecular pathways.［Methods］Establish a stable cell resistance model，continuous lavaging Xiaoyan decoction with different concentrations in 10 days，by serum pharmacology experiment method with drug-containing serum on lung adenocarcinoma cells resistant cells A549/DDP，through the QRT-PCR and Werstern Blot western Blot method to detect A549/DDP resistant，autophagy protein expression of related genes and related pathways.［Results］Resistance effect on lung adenocarcinoma cells A549/DDP with high dose Xiaoyan decoction，low dose Xiaoyan Decoction and normal saline，elimination saline resistance effect on lung adenocarcinoma cells A549/DDP，detecting drug-resistant related proteins in A549/DDP cell P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1mRNA and protein expression changes，through the detection of A549/DDP cells drug-resistant related proteins P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1mRNA and protein expression changes，high dose group of rock soup elimination processing cell lines after P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，both the HMGB1 mRNA and protein were lower（P＜0.05）.Further found that Xiaoyan decoction can affect the AKT1-elimination mTOR related genes and significantly reduce the AKT1，mTOR protein expression.［Conclusion］We hypothesized that Xiaoyan decoction influence elimination drug-resistant related proteins P-gp，LRP and Beclin1 protein involved in autophagy，HMGB1 genetic changes by AKT1-mTOR molecular pathways.

Xiaoyan decoction；autophagy；resistance；molecular pathway

R285.5

A

1672-1519（2016）06-0358-05

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.06.11

2016-01-16）