天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心脏Bax及Caspase-3蛋白表达的影响*

时晓迟，柳　威，王　娟，赵英强

（天津中医药大学第二附属医院心内科，天津　300150）

·实验研究·

天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心脏Bax及Caspase-3蛋白表达的影响*

时晓迟，柳威，王娟，赵英强

（天津中医药大学第二附属医院心内科，天津300150）

［目的］探讨天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠（SHR）的降压机制及对心肌组织B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达的影响。［方法］20只14周龄自发性高血压大鼠（SHR）随机分为空白组6只、中药组7只、西药组7只。中药组灌服天麻钩藤饮20 mL/（kg·d），相当生药20g/（kg·d）。西药组灌服雷米普利1 mg/（kg·d）。空白组灌服同体积的纯净水。连续灌胃4周。分别于给药0、1、2、3、4周测量血压和心率。给药4周后，腹主动脉取血处死，用酶联免疫吸附实验法测定血清血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量，用Western blot方法检测心肌组织Bax及Caspase-3蛋白表达。［结果］1）从给药3周后开始，与空白组比较，天麻钩藤饮能明显降低收缩压（P＜0.05，P＜0.01）。天麻钩藤饮降压效果虽没有西药明显，但整体上能控制收缩压的升高，并有逐渐降低的趋势。2）天麻钩藤饮和西药雷米普利对心率的变化均没有明显影响。3）与空白组比较，天麻钩藤饮和西药均能明显降低血清的AngⅡ和ALD含量（P＜0.01）。4）与空白组比较，天麻钩藤饮和西药均能明显降低心肌组织的Bax、Caspase-3蛋白表达（P＜0.01）。［结论］天麻钩藤饮能有效控制SHR大鼠收缩压的升高。天麻钩藤饮的降压机制可能与降低AngⅡ和ALD含量有关，并且还可能通过减少Bax、Caspase-3蛋白表达来抑制心肌细胞的凋亡，实现对心肌细胞的保护功能。

天麻钩藤饮；降压；AngⅡ；ALD；Bax；Caspase-3

高血压已成为严重危害人类健康的疾病之一。根据最新发布的《中国居民营养与慢性病状况报告（2015）》显示，2012年中国18岁及以上居民高血压患病率为25.2%，男性高于女性，城市高于农村，估计目前中国成人高血压患者约为2.6亿。与2002年相比，高血压患病率明显上升，农村地区增长尤为显著。目前国内高血压存在高发病率、高致残率、高病死率、低知晓率、低治疗率、低控制率的特征。高血压带来的严重后果就是心肌细胞肥大直至凋亡，最终导致心血管疾病终末期心衰的发生。因此，预防和控制高血压具有重要的意义。临床实践证实，天麻钩藤饮治疗高血压具有很好的疗效。而天麻钩藤饮对高血压所致的心肌细胞损伤是否具有保护作用还不明确。本研究就天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠心脏B细胞淋巴瘤-2基因相关X蛋白（Bax）及半胱氨酸天冬氨酶特异性蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达的影响进行考察。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR），体质量（250±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号：SCXK（京）2012-0001］。饲养于天津中医药大学实验动物中心，恒温（22±2）℃，自然昼夜，自由取食及饮水。

1.1.2药物天麻钩藤饮由天麻10 g，钩藤15 g（后下）、石决明20 g（先煎），山栀子6 g，黄芩6 g，川牛膝12 g，杜仲12 g，益母草12 g，桑寄生12 g，夜交藤12 g，茯苓12 g等组成。上述所有中药均由天津中医药大学第二附属医院中药房提供。天麻钩藤饮水提浓缩，相当于每毫升含生药1 g。雷米普利片购自赛诺菲安万特（北京）制药有限公司，国药准字H20060766，产品批号3JC001，规格5mg/片，7片/盒。

1.1.3主要仪器及试剂无创鼠尾压测量仪（BP98AWU，日本软隆）。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）检测试剂盒购自武汉优尔生商贸有限公司。Bax、Caspase-3、β-actin抗体均购自Abcam公司，二抗购自中杉金桥公司。

*基金项目：国家自然科学基金面上项目（81273941/H2902）；天津市自然科学基金资助项目（9JCZDJC20600）。

作者简介：时晓迟（1969-），女，硕士，副主任医师，从事心血管疾病临床及基础研究。

通讯作者：赵英强，E-mail：zhaoyingqiang1000@126.com。

表1　各组大鼠收缩压变化（±s）Tab.1　Comparison of average systolic blood pressure in rats in each group（±s）mmHg

表1　各组大鼠收缩压变化（±s）Tab.1　Comparison of average systolic blood pressure in rats in each group（±s）mmHg

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与西药组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别动物数　0周　1周　2周　3周　4周空白组　6　185.12±11.48　187.79±15.14　185.45±9.17　191.95±15.25　197.58±9.30中药组　7　178.17±11.54　183.28±16.12　178.60±5.83#　174.17±9.77*##　174.07±7.55**##西药组　7　178.53±6.35　175.32±18.81　155.67±15.52**　152.32±15.55**　156.28±9.67**

表2　各组大鼠心率变化（±s）Tab.2　Comparison of average heart rate in rats in each group（±s）　次/分

表2　各组大鼠心率变化（±s）Tab.2　Comparison of average heart rate in rats in each group（±s）　次/分

组别　动物数　0周　1周　2周　3周　4周空白组　6　453.12±44.83　372.83±76.23　373.66±40.12　435.75±22.34　421.02±36.52中药组　7　442.17±39.32　401.92±32.50　393.64±45.90　426.28±32.88　423.21±46.56西药组　7　452.67±31.17　419.82±49.45　421.35±44.01　420.46±18.36　439.25±22.52

1.2方法

1.2.1分组与给药20只12周龄SHR适应性饲喂2周后，按照随机数字表法随机分为空白组6只、中药组7只、西药组7只。中药组灌服天麻钩藤饮20 mL/（kg·d），相当生药20 g/（kg·d）。西药组灌服雷米普利1 mg/（kg·d）。空白组灌服同体积的纯净水。连续灌胃4周。

1.2.2血压、心率测量采用尾动脉无创测量法。在干燥、通风、安静的环境中将大鼠置于37℃恒温袋内预热10 min，使大鼠尾动脉充分扩张，将传感器套在鼠尾根部，待大鼠短暂躁动停止后，连续测定3次取平均值。分别于给药0、1、2、3、4周测量血压和心率。

1.2.3血清AngⅡ、ALD含量测定取大鼠腹主动脉血，加入离心管中，37℃水浴锅充分凝血，4℃、3 000 r/min离心5 min，取血清，参照ALD和AngⅡ测定试剂盒说明书，进行酶联免疫吸附实验法测定。

1.2.4Bax、Caspase-3蛋白检测大鼠腹主动脉取血处死后，剪取心脏组织，冲洗净，取心尖部位心肌组织约30 mg，超声破碎匀浆，BCA法检测蛋白浓度。加入十二烷基硫酸钠（SDS），沸水中变性。聚丙烯酰胺凝胶电泳，PVDF转膜，5%脱脂奶粉封闭，孵育一抗，4℃过夜，充分洗净，孵育二抗，室温2 h，洗净后进行化学发光，胶片显影、定影，将胶片进行扫描，用Image-J软件计算目标带的灰度值。

1.3统计方法采用SPSS 18.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用方差分析进行统计处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组大鼠收缩压的变化情况0周时，各组之间差异无统计学意义，说明分组合理，基线平稳，具有可比性。2周后，与空白组比较，西药组收缩压明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；与空白组比较，中药组虽有降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。从给药3周后开始，与空白组比较，中药组收缩压明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与空白组比较，西药组均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。从给药2周后开始，西药组收缩压降低更明显，与中药组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

2.2各组大鼠心率的变化情况给药前后，各组大鼠的心率变化不明显，组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3血清AngⅡ和ALD含量变化情况给药4周后，检测血清AngⅡ和ALD含量。与空白组比较，给药组血清的AngⅡ和ALD含量均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。其中西药组血清的AngⅡ降低更显著，与中药组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表3。

表3　AngⅡ和ALD含量的比较（±s）Tab.3　Comparison of AngⅡand ALD contents（±s）

表3　AngⅡ和ALD含量的比较（±s）Tab.3　Comparison of AngⅡand ALD contents（±s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与西药组比较，##P＜0.01。

组别　动物数　AngⅡ（ng/L）　ALD（pg/mL）空白组　6　2156.17±39.95　218.12±14.89中药组　7　1678.57±50.44**##　143.24±12.56**西药组　7　1534.25±40.78**　140.79±10.22**

2.4心肌组织Bax、Caspase-3蛋白表达变化情况给药4周后，检测心肌组织Bax、Caspase-3蛋白含量。与空白组比较，给药组心肌组织的Bax、Caspase-3蛋白表达均明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。其中西药组心肌组织Caspase-3蛋白表达减少更显著，与中药组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1　心肌组织Bax、Caspase-3蛋白表达变化Fig.1　Comparison of Bax，Caspase-3 protein expression in myocardial tissue

3　讨论

高血压已经成为危害人类健康的主要疾病，心脏是高血压的靶器官之一。高血压导致心脏后负荷过重，长期的后负荷过重会引起心脏结构和功能改变，终至失代偿，心脏排血量下降，发生心力衰竭。研究表明，心肌细胞凋亡在高血压心肌肥厚和心力衰竭发病中发挥重要作用［1］。在心肌细胞凋亡过程中，Bax、Caspase蛋白发挥重要作用［2-4］。Caspase家族在激活的主动性细胞死亡过程中起着关键作用，是多种凋亡途径的汇聚点，是执行细胞凋亡的最后路径。由于Caspase能够自我活化，所以一旦激活就会触发凋亡过程，呈级联放大效应。其中Caspase-3是凋亡的关键蛋白酶，位于级联反应下游，能被上游的始动子激活，然后作用于底物使细胞发生改变，导致细胞凋亡的发生［5-6］。Bax是促进由Caspase介导的细胞凋亡的重要蛋白，它属于Bcl-2家族。Bax可与Bcl-XL相互作用，激活Caspase级联反应，加快细胞凋亡［7-8］。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）内部存在一种蛋白水解级联反应，是调节血压的一个重要系统。AngⅡ有强烈的收缩血管作用，而且可通过刺激肾上腺皮质球状带，促使ALD分泌，潴留水钠，刺激交感神经活性，使血压升高。目前主要的降压药物研究也多围绕此系统开展［9-10］。一些研究表明，AngⅡ、ALD除了参与血压调节外，也参与了心肌细胞的凋亡［11］。

天麻钩藤饮出自近代胡光慈所著《杂病证治新义》，由天麻、钩藤、生决明、山栀、黄芩、牛膝、桑寄生、杜仲、夜交藤、茯神组成。临床实践及基础研究证实天麻钩藤饮具有明显的降压效果［12-15］，并且还能有效改善高血压患者的生活质量［16-19］。

本研究证实，从给药3周后开始，与空白组比较，天麻钩藤饮能明显降低收缩压，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。天麻钩藤饮降压效果虽没有西药明显，但整体上能控制收缩压的升高，并有逐渐降低的趋势。随着给药时间的延长，天麻钩藤饮有可能会进一步降低收缩压。本研究发现天麻钩藤饮和西药雷米普利对心率的变化均没有明显影响。本研究进一步对降压机制进行研究，发现天麻钩藤饮和西药均能明显降低血清的AngⅡ和ALD含量，差异具有统计学意义（P＜0.01）。由于高血压能引起心肌细胞肥厚直至凋亡，因此本研究就心肌细胞凋亡的关键蛋白Bax、Caspase-3进行检测，结果显示，天麻钩藤饮和西药均能明显降低心肌组织的Bax、Caspase-3蛋白表达，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

综上所述，天麻钩藤饮能有效控制SHR收缩压的升高，随着给药时间延长，降压效果可能会更明显。天麻钩藤饮降压机制可能与降低AngⅡ和ALD含量有关，并且还可能通过减少Bax、Caspase-3蛋白表达来抑制心肌细胞的凋亡，实现对心肌细胞的保护功能。

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（本文编辑：马英，高杉）

Effect of the Tianma Gouteng Yin regulating the protein expression of Bax and Caspase-3 of myocardial tissue in spontaneously hypertensive rats

SHI Xiao-chi，LIU Wei，WANG Juan，ZHAO Ying-qiang
（Department of Cardiology，The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300150，China）

［Objective］To investigate the mechanism of Tianma Gouteng Yin（TMGTY）reducing blood pressure and the protein expression of Bax and Caspase-3 in myocardial tissue in spontaneously hypertensive rats.［Methods］Twenty 14-week-old SHR rats were randomly assigned to control group（n=6），TCM group（n=7）and Western medicine group（n=7）.The rats in TCM group were given TMGTY with the dose of 20 g/（kg·d）；those in the western medicine group were given ramipril［1 mg/（kg·d）］；those in control group were given the same volume of pure water.Blood pressure and heart rate were measured weekly.After 4 weeks，abdominal aortic blood and sacrifice animals.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to analyze the content of AngⅡand ALD in serum.Western blot was used to analyze quantitatively Bax and Caspase-3.［Results］1）Starting from the third week after the administration，compared with the control group，TMGTY significantly reduced systolic blood pressure（P＜0.05，P＜0.01）.Although not significant antihypertensive effect，TMGTY controlled the overall increase in systolic blood pressure，and systolic blood pressure gradually decreased.2）TMGTY and ramipril had no significant effect on heart rate.3）Compared with the control group，TMGTY and ramipril significantly reduced the content of AngⅡand ALD in serum（P＜0.01）.4）Compared with the control group，TMGTY and ramipril significantly reduced the protein expression of Bax and Caspase-3 in myocardial tissue（P＜0.01）.［Conclusion］TMGTY could effectively control the increase in systolic blood pressure in SHR.The antihypertensive mechanism of TMGTY may be reducing ALD and AngⅡ.Further，by reducing the protein expression of Bax and Caspase-3，TMGTY possibly inhibited the apoptosis of cardiomyocytes，and achieved protection to cardiomyocytes. Key words：Tianma Gouteng Yin；reducing blood pressure；AngⅡ；ALD；Bax；Caspase-3

R541.3

A

1672-1519（2016）06-0354-04

2016-02-28）