淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

焦红梅,杨　慧,赵　丹,李国才,陈红菊,严　华,季明春

(扬州大学医学院 病原生物学与免疫学教研室,江苏 扬州,225001)



论著

淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

焦红梅,杨慧,赵丹,李国才,陈红菊,严华,季明春

(扬州大学医学院 病原生物学与免疫学教研室,江苏 扬州,225001)

摘要:目的克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白PorB,以重组蛋白为抗原，间接ELISA检测免疫血清的抗体水平。方法利用PCR从淋病奈瑟菌WHO 株基因组中扩增出PorB的基因，克隆入原核表达载体 pET-30a 中，构建出重组表达质粒 pET30a-PorB,并转化大肠杆菌 BL21(DE3)中，异丙基 β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导表达。表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性。以纯化的重组蛋白 rPorB 作为检测抗原建立间接ELISA 方法，用于检测淋病疫苗 pVAX1-PorB 免疫小鼠后的血清抗体水平。结果PCR 扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白 PorB 基因，表达的重组蛋白rPorB相对分子质量约40 kD,经Ni-NTA亲和层析纯化后的 rPorB 在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot 证明纯化后的 rPorB 可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合，具有良好的免疫反应性。间接 ELISA 结果表明，淋病疫苗pVAX1-PorB免疫小鼠血清PorB特异性抗体滴度为1∶200。结论成功构建了重组原核表达质粒pET30a-PorB,PorB 在大肠杆菌中获得表达。以纯化的rPorB为检测抗原，间接 ELISA 可以用于淋病疫苗免疫效果的评价。该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础。

关键词:淋病奈瑟菌; 孔蛋白PorB; 原核表达; 免疫检测

淋病是一种由淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)引起的泌尿生殖系统黏膜的急性或慢性化脓性炎症,是世界范围内发病率较高的性传播疾病(STD)之一。WHO[1-3]统计表明,全球每年新增病例1.06 亿，淋病发病率居中国性传播疾病首位，危害十分严重。淋病奈瑟菌主要经性接触传播，主要感染女性的宫颈和男性的尿道，也可侵犯眼结膜、咽部、肛门和直肠。男性感染者可表现为尿道炎、前列腺炎等，女性感染者可表现为子宫内膜炎、盆腔炎，甚至不孕等。超过一半的感染者呈现无症状感染状态[4]。淋病奈瑟菌易于引起传染和重复感染，且使 HIV 共感染的概率大大增加[5-7]。孔蛋白 B(Por B)是存在于淋病奈瑟菌外膜上抗原高度保守的外膜蛋白，是细菌中含量最多的外膜蛋白。研究[8-9]表明孔蛋白具有较强的免疫原性，能诱导机体产生保护性免疫反应。本研究以淋病奈瑟菌 WHO-A株基因组DNA为模板扩增Por B基因，构建了重组原核表达质粒pET30a -PorB,然后将其转入大肠杆菌 BL21(DE3)中,IPTG 诱导 PorB 蛋白的表达。

1材料与方法

1.1材料与试剂

淋病奈瑟菌WHO-A株购自中国药品生物制品检定所; E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)由本实验室保存; 原核表达载体pET-30a购自Novagen公司。淋病奈瑟菌真核表达质粒pVAX1-PorB 由本室构建保存。质粒小量提取试剂盒、限制性内切酶Nde Ⅰ 及Xho Ⅰ 、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、DNA Marker和高保真酶Prime Star Max等购自TaKaRa生物工程(大连)有限公司; IPTG购自上海生物工程有限公司。羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗和底物显色液(TMD)购自北京天根生物工程公司; 其他试剂为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1引物的设计与合成:参照GenBank中淋病奈瑟菌PorB基因的序列，设计合成一对引物:上游引物(NPIBF):CGGCATATGAAAAAATCCCTGATTGCCCTG,含有Nde Ⅰ酶切位点；下游引物(XPIBR):CCCCTCGAGGAATTTGTGGCGCAGAACGAC,含有Xho Ⅰ酶切位点。这对引物覆盖整个PorB基因，预期扩增目的片段大小为1053 bp,由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2.2PCR扩增PorB基因:以淋病奈瑟菌WHO株基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因PorB，具体方法参照 Prime Star Max说明书进行。扩增体系:100 μL体系中含有基因组 50 ng,Prime Star Max 50 μL,NPIBF 4 μL,XPIBR 4 μL。循环条件:98 ℃ 10 s,55℃ 5 s,72℃ 30 s,30次循环。

1.2.3重组原核表达质粒的构建和鉴定:用限制性内切酶Nde I和Xho Ⅰ分别双酶切PCR 产物和原核表达载体pET-30a。目的基因片段和载体片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经双酶切鉴定为阳性的重组质粒命名为pET30a-PorB，送上海生工生物工程技术有限公司测序，用DNAStar软件对测序结果进行分析。

1.2.4重组菌的诱导表达及目的蛋白的纯化:将测序正确的重组质粒pET30a-PorB转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，涂布于含卡那霉素的LB 琼脂平板。挑取阳性克隆接种于含卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃过夜培养。次日，以1∶500接种于含卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃振荡培养至菌液OD600为0.4～0.5时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG,37 ℃ 振荡培养4 h。菌液经离心、重悬后，进行SDS-PAGE分析。同时设空载体pET-30a转化的BL21(DE3)作为对照。用Ni-NTA亲和层析柱对目的蛋白进行纯化，具体方法参照说明书进行。

1.2.5重组蛋白的Western blot鉴定:重组蛋白经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜,PBST洗膜后，用含有10% FCS的PBST封闭过夜。PBST洗膜后，以1:200稀释的淋病奈瑟菌免疫血清为一抗,HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，观察特异蛋白条带。同时设空载体为对照。

1.2.6间接ELISA方法的检测:淋病奈瑟菌重组质粒pVAX1-PorB经肌肉途径免疫6～8周龄BALB/c小鼠3次，每次免疫间隔2周，于末次免疫后2周采集小鼠血清，间接ELISA检测PorB抗体。以纯化的PorB蛋白包被酶标板,4 ℃过夜。次日用PBST清洗3次，用含10%小牛血清的PBS进行封闭。以稀释的免疫鼠血清为一抗，同时设PBS免疫组为阴性对照。HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗，加入底物TMB显色，用2 mol/L H2SO4终止反应后测 OD450值。以P(待测样品 OD450值)/N(阴性对照OD450值)≥2.1判为阳性。

2结果

2.1PorB的PCR扩增结果

根据PorB基因序列设计一对引物，以淋病奈瑟菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示在1.0 kb处出现一条特异性条带，与预期的片段大小相符。见图1。

M.250 bp DNA ladder Marker; 1.PorB基因扩增产物

图1PCR扩增PorB 基因

2.2重组原核表达质粒pET30a- PorB的构建和鉴定

PCR产物经双酶切后连接入原核表达载体 pET-30a 中，经双酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳后，出现1.0 kb的目的片段和5.4 kb的载体片段。见图2。序列测定结果表明,PorB大小为1053 bp,与GenBank公布的多株淋病奈瑟菌孔蛋白PorB 的序列具有100%的同源性。说明重组质粒 pET30a-PorB 构建成功。

M.Wide Range DNA Marker (100-6，000);1.pET30a-PorB digested by restriction enzymes Nde I and XhoI

图2重组表达质粒pET30a- PorB的双酶切鉴定

2.3重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

将含有重组质粒pET30a-PorB的大肠杆菌 BL21(DE3)在37 ℃诱导后，诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果显示，与未诱导的菌液相比，诱导表达的BL21(DE3)-pET30a-PorB在40 kD处出现一条明显的蛋白条带，目的蛋白经镍柱纯化后得到纯化蛋白。见图3。

M:蛋白质marker;1,3:BL21(DE3)-pET30a-PorB(诱导);2:BL21(DE3)-pET30a-PorB(未诱导);4:BL21(DE3)-pET30a(未诱导);5:BL21(DE3)-pET30a(诱导);6:BL21(DE3)-pET30a-PorB(诱导纯化后)图3 表达产物的SDS-PAGE分析

2.4重组蛋白的 Western blot鉴定

将重组蛋白 rPorB 进行SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，以鼠抗淋病奈瑟菌免疫血清为一抗，以辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析。结果表明，rPorB在相应位置上出现特异性条带(图4),表明rPorB与鼠抗淋病奈瑟菌抗体发生特异性结合，具有良好的免疫反应性。

M:蛋白质marker;1:BL21(DE3)-pET30a;2:BL21(DE3)-pET30a-PorB图4 重组蛋白的Westernblot分析

2.5间接ELISA检测

通过方阵实验确定蛋白最佳包被浓度为5μg/mL,间接ELISA检测免疫小鼠血清特异性抗体水平。结果表明，淋病奈瑟菌疫苗pVAX1-PorB三免后免疫小鼠血清抗体水平在1∶200。见图5。以上结果说明表达的重组蛋白rPorB具有良好的免疫反应性。

图5 免疫血清的ELISA检测

3讨论

淋病奈瑟菌外膜蛋白主要有外膜蛋白Ⅰ (PⅠ ,称孔蛋白)、外膜蛋白Ⅱ(PⅡ,又称不透明蛋白) 和外膜蛋白Ⅲ(PⅢ,又称还原修饰蛋白)。其中,PⅠ 是主要外膜蛋白，占有外膜蛋白含量的60%,在淋病奈瑟菌的致病过程中发挥着重要作用。孔蛋白单体主要由β-蛋白折叠和无规则卷曲组成的三聚体结构，分为PorA 和PorB两种亚型。流行病学研究显示,PorB是主要亚型。研究[10-13]表明，它可以介导离子交换，在免疫应答的过程中可通过活化B细胞和其他抗原递呈细胞发挥佐剂的活性。孔蛋白可以和人工膜、脂质双层膜和靶细胞膜直接作用。通过细菌和细胞紧密接触的区域，孔蛋白可结合和进入上皮细胞膜、易位于线粒体，导致线粒体膜电势降低，介导细胞的凋亡[14-15]。孔蛋白能持续在淋病奈瑟菌细胞膜表面表达，具有较强的免疫原性，能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，是理想的淋病疫苗侯选成分。同时，其抗原变异相对缓慢，可作为重要的诊断抗原。本研究通过PCR扩增获得淋病奈瑟菌WHO株孔蛋白PorB的开放读码框全长序列为1 053个碱基，编码351个氨基酸。序列分析结果表明，与GenBank 公布的淋病奈瑟菌MS11株等的孔蛋白PorB 序列具有100%的同源性。以pET30a为表达载体，构建了pET30a-PorB重组质粒并实现了在E.coli BL21(DE3)中的表达，表达产物经镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白rPorB。Western blot 检测结果表明重组蛋白rPorB能被淋病奈瑟菌免疫鼠血清识别。为了进一步检测重组蛋白rPorB的免疫特性，以重组蛋白rPorB为检测抗原，建立了间接ELISA方法，检测淋病奈瑟菌疫苗的免疫原性。结果表明，重组蛋白rPorB可以用于检测淋病奈瑟菌疫苗诱导的抗体应答，为淋病奈瑟菌感染诊断和疫苗的研制奠定了基础。

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收稿日期:2016-04-03

基金项目:国家自然科学基金(31100652; 81471906); 江苏省自然科学基金(14KJB310025)

中图分类号:R 759.2

文献标志码:A

文章编号:1672-2353(2016)15-001-04

DOI:10.7619/jcmp.201615001

Prokaryotic expression of PorB gene from neisseria gonorrhoeae and its primary application in serological detection

JIAO Hongmei,YANG Hui,ZHAO Dan,LI Guocai, CHEN Hongju,YAN Hua,JI Mingchun

(Department of Pathogenic Biology and Immunology,Medical College of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001)

ABSTRACT:ObjectiveTo clone the PorB protein of neisseria gonorrhoeae and use indirect ELISA to evaluate the titers of antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine.MethodsThe complete PorB gene from neisseria gonorrhoeae strain WHO was amplified by PCR and subcloned into the pET-30a vector to construct recombinant plasmid pET30a-PorB.Then the resultanting plasmid pET30a-PorB was transformed into E.coli BL21(DE3) and the expression of the Por B protein was induced with IPTG.The expressed PorB protein was purified by Ni2+-chelating chromatography and detected by SDS-PAGE and Western blot.ResultsPorB gene was 1053 bp in length.SDS-PAGE analysis indicated that the molecular weight of the recombinant protein was about 40 kD.The recombinant protein could react with polyclonal antibody against neisseria gonorrhoeae.Mouse antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine recognized rPorB,indicating that rPorB had a good immunogenicity.ConclusionThe rPorB is successfully expressed and the indirect ELISA with it as coating antigen can be used to evaluate the titers of antibodies against neisseria gonorrhoeae vaccine.These results lay foundation for the diagnosis of neisseria gonorrhoeae infection and the research of vaccine of neisseria gonorrhoeae.

KEYWORDS:neisseria gonorrhoeae; rPorB; prokaryotic expression; indirect ELISA