双氢青蒿素诱导肝癌细胞Huh-7凋亡并抑制其迁移的机制研究

郭俊　杨靖　李艳



·论著·

双氢青蒿素诱导肝癌细胞Huh-7凋亡并抑制其迁移的机制研究

郭俊杨靖李艳

430060 武汉大学人民医院检验科(郭俊、李艳)；442000 十堰，湖北医药学院附属人民医院感染性疾病科(杨靖)

【摘要】目的探讨双氢青蒿素(DHA)能否影响具有突变型p53的人肝癌细胞株Huh-7增殖、凋亡及迁移等生物学行为及其作用机制。方法DHA处理Huh-7细胞后MTT法检测增殖抑制率，免疫荧光分析DNA双链损伤情况，WB法测γH2AX蛋白表达水平，流式细胞术检测细胞凋亡。细胞划痕法检测DHA对细胞迁移能力的影响。WB法测细胞中STAT3蛋白的活性及表达水平。结果DHA能抑制Huh-7细胞的增殖活性，抑制作用呈浓度依赖性。20 μmol/L DHA处理48 h能升高γH2AX表达水平，损伤Huh-7细胞DNA双链。DHA处理48 h细胞的凋亡百分率为(3.15±0.39)%。DHA降低Huh-7细胞迁移能力，p-STAT3(Y705)表达水平下降。结论DHA能造成Huh-7细胞DNA双链损伤，诱导细胞凋亡，但此过程与p53活性无关。可能的机制是通过降低STAT3磷酸化水平抑制突变型p53的Huh-7细胞增殖，诱导Huh-7细胞凋亡和抑制细胞迁移。

【主题词】原发性肝细胞癌；双氢青蒿素；细胞增殖；细胞凋亡

Fund program: Initial Project for Post-Graduates of Hubei University of Medicine (2015QDJZR08)

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见恶性肿瘤，死亡率高居癌症的第三位[1]。抗肿瘤药物耐受及肿瘤细胞的不断侵袭和迁移限制了HCC的放疗、化疗效果。双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)作为抗疟疾药物青蒿素的重要衍生物，能在体内外发挥抗肿瘤作用，极有潜力成为价廉且有效的抗癌药[1-3]。研究显示，DHA能通过降低血管内皮生长因子及其受体的表达而抑制大鼠原发性肝癌及小鼠肿瘤的血管生成，促进肝癌凋亡[4,5]。DHA在体外能诱导具有野生型p53的人肝癌SMMC-7721[5]细胞及HepG2细胞凋亡[6]。但DHA对p53失活的HCC细胞生物学的作用及其机制方面研究甚少。本研究通过对DHA在体外对具有突变型p53的Huh-7细胞凋亡及迁移的影响研究，探索DHA在体外对肝癌细胞Huh-7的生物学作用机制，为DHA在肝癌治疗中的进一步应用提供科学依据。

1材料与方法

以不同浓度DHA分别处理Huh-7细胞，用MTT法检测各组细胞的增殖抑制率，确定IC50。用此浓度的DHA处理Huh-7细胞，Etoposide作为DNA双链损伤的阳性质控药物，γH2AX抗体孵育后免疫荧光分析DNA双链损伤情况，Western Blot法检测γH2AX蛋白表达水平变化进行验证。采用流式细胞术检测DHA处理后Huh-7细胞凋亡。细胞划痕法检测DHA对细胞迁移能力的影响。Western Blot法检测各组细胞中STAT3蛋白的活性及表达。

1.1材料

1.1.1细胞系：人肝癌细胞株Huh-7为四川大学李明远教授惠赠。

1.1.2主要试剂和抗体：DHA、EtoposideMTT试剂均购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC Apoptosis Kit购自BD Biosciences；兔抗人γH2AX抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人p-STAT3(Y705)及STAT3均购自上海生工生物工程股份有限公司，兔抗人β-actin抗体及羊抗兔IgG-Cy3荧光抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养：用含10%小牛血清、1%青链霉素双抗的DMEM(高糖)培养基作为完全DMEM培养基。细胞接种后置5% CO2孵箱中37 ℃连续培养。

1.2.2细胞分组及药物处理：NC组：20 μmol/L DMSO处理48 h；DHA组：20 μmol/L双氢青蒿素处理48 h；Eto组：20 μmol/L依托泊苷处理48 h。

1.2.3MTT检测细胞体外增殖能力：铺96孔板(5000～10000个细胞/100 μl/孔)，37 ℃孵育，过夜；弃培养基，换成含有药物的含10%小牛血清的DMEM培养基处理48 h，每组3复孔，同时设置调零孔(DMEM、MTT、DMSO)和对照孔(细胞、DMEM、MTT、DMSO)；在预订的时间点每孔加入5 mg/ml 的MTT溶液10 μl(终浓度为0.5% MTT)，继续培养4 h；小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，置摇床上低速振荡至结晶完全溶解；用酶联免疫检测仪测量各孔光密度值(OD490 nm)；细胞活性按下列公式[77]计算：细胞活性(%)=(OD490 nm-OD空白)处理组/(OD490 nm-OD空白)对照组×100%。

1.2.4免疫荧光分析DNA双链损伤情况：将细胞以合适的浓度接种于预先放有无菌小玻片的24孔板中，培养细胞至汇合度约80%；药物处理48 h后，4% PFA固定,0.25% Triton X-100通透；封闭后，与兔抗人γH2AX抗体孵育，再经抗兔IgG-Cy3荧光标记物的二抗孵育；DAPI封片后，荧光显微镜下拍照。

1.2.5Annexin V-FITC/PI双染检测凋亡细胞数：铺6孔板(1 × 105个细胞/孔)，每组3复孔，37 ℃孵育过夜；药物处理48 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化处理、离心收集细胞；经冷PBS 洗涤细胞两次后，按说明书在细胞悬浮液(浓度大约为1 ×106cells/ml)中加入Annexin V-FITC及碘化丙啶(propidium iodide，PI)，轻轻混匀后4 ℃ 避光孵育5 min，在1 h内用流式细胞仪检测；以Annexin V-FITC阳性率作为凋亡细胞百分率。

1.2.6细胞划痕法检测细胞迁移能力：用灭菌的10 μl枪头在单层细胞上呈一直线划痕，无血清培养液轻柔洗涤，去除悬浮细胞，药物处理24 h。换成完全DMEM培养基，继续培养24 h，用倒置相差显微镜观察划痕之间的距离变化。

1.2.7Western Blot检测γH2AX、pSTAT3及STAT3蛋白表达：适量1×SDS上样缓冲液裂解药物处理后的Huh-7细胞，吸取细胞裂解液于EP管中，98 ℃煮5 ～10 min，离心后上清为蛋白样品。样品进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭；一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，洗膜后与二抗(1∶5 000)室温孵育30 min；洗膜后加ECL显影液，放入凝胶分析系统中曝光，拍照存储并用Quantity One软件分析计算各条带的灰度值，以每组目的蛋白和内参蛋白灰度值的比值表示各组蛋白的表达水平。

1.3统计学方法各组实验数据用SPSS 16.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较用turkey检验，结果中数据用均数±标准差的方式表示 (n=3)，P<0.05为差异有统计学意义。

A 不同浓度DHA处理Huh-7细胞48 h后的增殖抑制率；B 倒置相差显微镜观察细胞数目的减少情况(100×) 图1　MTT检测细胞体外增殖能力A Inhibition of Huh-7 cells proliferation in medium containing DHA in different concentrations after cultured 48 hour;B The changes of Huh-7 cells form observed by upside down and discrepancy microscopeFig.1　Cellular proliferation capacity detection with MTT

A 荧光显微镜观察细胞爬片中γH2AX表达情况(红色荧光，400×)；B Western Blot检测γH2AX表达水平变化； C 条带灰度值用Quantity One软件分析结果图2　DHA导致Huh-7细胞发生双链DNA损伤A　Observing the cells climbing to the carry sheet glass under a fluorescent microscope, which are stained with antibody of γH2AX (red fluorescence, 400×);B　The expression levels of γH2AX were detected by Western Blot assay;C　The result of gray-scale value of straps was analyzed by Quantity One softwareFig.2　DHA lead to DNA double-strand break of Huh-7 cell line

2结果

2.1DHA抑制Huh-7细胞增殖不同浓度的DHA作用Huh-7细胞48 h，细胞增殖活性均被抑制，DHA对Huh-7细胞增殖活性的抑制作用有剂量依赖性(图1A)。48 h时，IC50为20 μmol/L，选用20 μmol/L DHA作用48 h作为下述实验作用浓度和时间。倒置相差显微镜观察，DHA处理后均能减少Huh-7细胞数目(图1B)。

2.2DHA导致Huh-7细胞发生双链DNA损伤细胞爬片用γH2AX抗体染色，实验组DHA组与阳性对照组Eto组发生DNA双链损伤的细胞数目均增多(图2A)。与NC组相比，DHA使γH2AX表达水平升高(4.00±0.30)(图2)，DHA能诱导Huh-7细胞发生DNA双链损伤。

2.3DHA能诱导Huh-7细胞凋亡Annexin V-FITC/PI双染后进行流式细胞计数结果显示，Huh-7细胞的凋亡百分率DHA组(3.15±0.39)及Eto组(9.21±0.41)比NC组(1.03±0.29)均上调，差异具有统计学意义(P<0.05，图3)，DHA能诱导Huh-7细胞凋亡。

2.4DHA抑制Huh-7细胞迁移划痕实验显示对照组Huh-7细胞迁移能力强，而DHA处理后，细胞向划痕处爬行的速度明显慢于对照组和Eto组，DHA使Huh-7细胞迁移能力降低 (图4)。

2.5DHA降低了STAT3的磷酸化水平Western blot检测结果显示，Huh-7细胞存在p-STAT3(Y705)，即STAT3处于活化状态(图5A)。DHA处理不影响STAT3蛋白的表达，但降低了p-STAT3(Y705)蛋白表达水平(3.21±0.23)(图5B)。

A　Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞术检测凋亡细胞数目的散点图；B　凋亡百分率柱状图，*表示与NC组比较，P<0.05图3　DHA处理Huh-7细胞的凋亡率A　Scatter diagram to inspect the number of apoptotic cells were employed by Flow cytometry with the Annexin V-FITC/PI double staining;B　Histogram to assess the changes of Huh-7 cells apoptosis percentage;*Compared with NC group, P<0.05Fig.3　Apoptosis rate of Huh-7 cells delection with flow cytometer

图4　倒置相差显微镜观察划痕之间的距离变化(100×)Fig.4　Cellular migration abilities of Huh-7 cells was detected by scratch test with upside down and discrepancy microscope(100×)

A Western Blot检测p-STAT3(Tyr705)表达水平变化；B 条带灰度值用Quantity One软件分析结果图5　Western blot检测DHA处理后Huh-7细胞中STAT3蛋白的活性及表达A　The expression levels of p-STAT3(Y705)were detected by Western blot assay;B　The results of gray-scale value of straps was analyzed by Quantity One softwareFig.5　Western blot assay was used to examine the expression and the activity of the STAT3 protein

3讨论

DNA双链断裂是机体最致命的DNA损伤，能激活p53等凋亡通路，但约有50%肝癌存在p53功能的缺失、突变或失活[7]。目前，DHA与肝癌肿瘤细胞的相互作用机制尚不明确，Hou等[8]发现DHA可以通过caspase-3通路诱导Huh-7细胞和BEL-7404细胞(突变型p53)发生凋亡。

STAT3 作为EGFR、IL-6/JAK和PI3K/Akt/mTOR等信号通路汇聚的焦点，参与肿瘤的凋亡、侵袭、转移、血管生成和免疫抑制，是信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription，STATs)蛋白家族中与肿瘤发生、发展关系最为密切的一个成员。STAT3活性抑制剂能否成为肝癌的治疗药物仍然处在探索研究阶段，STAT3失调与肝癌发生、发展及耐药等相关[9,10]。降低或抑制STAT3活性，会增敏放化疗效果。STAT3 活化的标志是705 位的酪氨酸(Tyr705)发生磷酸化[11]。实验证实Sorafenib能通过抑制STAT3活性，增敏PLC5、Huh-7、Sk-Hep1及Hep3B细胞的放疗效果[12]。新型组蛋白脱乙酰基酶抑制剂Panobinostat(LBH589)能通过降低p-STAT3(Tyr705)的表达水平诱导肝癌细胞凋亡[13]。乙酰基转移酶抑制剂 garcinol能结合肝癌细胞中的STAT3的SH2结构域阻止其二聚体化诱导肝癌细胞凋亡[14]。

Ho等[15]认为DHA是具有多靶标的药物，能通过抑制STAT3活性发挥抗炎、抗肿瘤等多种生物学作用。本研究发现DHA能造成Huh-7细胞DNA双链断裂，降低p-STAT3(Tyr705)表达水平；进一步诱导Huh-7细胞凋亡，抑制Huh-7细胞迁移，且此过程与p53的活性无关。综上所述，价廉易于获取的DHA有望成为治疗肝癌的新突破。

4参考文献

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通信作者：李艳， Email: 20090077@hbmu.edu.cn

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.005

基金项目：湖北医药学院博士启动金(2015QDJZR08)

(收稿日期：2016-04-12)

Molecular mechanism of dihydroartemisinin to induce apoptosis and inhibit migration in human liver cancer cell line Huh-7

GuoJun,YangJing,LiYan

DepartmentofClinicalLaboratory,People’sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China(GuoJ，LiY);DepartmentofInfectiousDisease,People’sHospitalofHubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China(YangJ)Correspondingauthor:LiYan,Email: 20090077@hbmu.edu.cn

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of DHA on the cell proliferation, apoptosis, and migration in human liver cancer cell line Huh-7 with mutant TP53 in vitro. MethodsMTT assay was used to detect the inhibitory effect. Immunofluorescence assay and WB were applied to detect the expression of γH2AX after treatment of DHA. FCM was employed to assess the apoptosis rate. Scratch method was used to test the cell migration ability. Western blot was used to determine the expression of p-STAT3(Y705). ResultsDHA inhibited the cell proliferation in Huh-7 cells.The results of immunofluorescence assay and WB showed that DHA enhanced the expression level of γH2AX and induced the DNA double-strand break (DSB) in Huh-7 cells. WB showed that DHA downregulated the phosphorylation of STAT3 at the Tyr705. ConclusionsDHA caused the DSB and induced apoptosis in Huh-7 cells regardless of p53 status. DHA inhibited cell proliferation and migration of Huh-7 cells. It is probable that DHA induced apoptosis via downregulation of p-STAT3 (Tyr705).

【Key words】Hepatocellular carcinoma; Dihydroartemisinin; Cell proliferation; Cell apoptosis