鼠诺如病毒MNV-CW1感染C57BL/6小鼠的特点

庞立丽　靳淼　王慧敏　王莹　陈爱珺　李慧颖　章青　高福　段招军



·论著·

鼠诺如病毒MNV-CW1感染C57BL/6小鼠的特点

庞立丽靳淼王慧敏王莹陈爱珺李慧颖章青高福段招军

100101 北京，中国科学院微生物研究所[庞立丽(博士后)、高福]；102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所(庞立丽、靳淼、陈爱珺、李慧颖、章青、段招军)；010110 呼和浩特，内蒙古医科大学(王慧敏、王莹)

【摘要】目的探讨鼠诺如病毒(Murine noroviurs, MNV)感染C57BL/6小鼠后临床及生物学特征，了解MNV的感染特点。方法将MNV-CW1毒株以高剂量(104PFU/只)和低剂量(102PFU/只)分别灌胃到C57BL/6小鼠体内，建立MNV感染小鼠模型。对感染小鼠进行体征观察和体温检测，检测粪便和血液排毒情况、组织中病毒的分布情况以及十二指肠病理切片检查。结果感染的小鼠没有明显的体表变化，没有腹泻、发热等临床症状和病理改变。粪便检测感染后1～2 d排毒。在感染后第3天部分血液中检测到MNV RNA。主要感染部位为消化系统和脾脏。 结论本研究建立的MNV-CW1感染C57BL/6小鼠模型为MNV感染小鼠致病机制进一步研究提供实验信息和技术支撑。

【主题词】鼠诺如病毒；小鼠；实验感染

Fund programs: China Postdoctoral Science Foundation (2015M580142)

诺如病毒(Noroviruses, NoVs)属于杯状病毒科(Caliciviridae family),是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原[1]。NoV变异快，环境抵抗力强，传播途径多样，全人群普遍易感，疾病负担严重。NoV很难在体外复制分离，仅有文献报道在细菌感染的帮助下成功用B细胞培养成功[2]。缺少成熟的体外复制体系和合适的小动物感染模型，严重阻碍了NoV致病机理等方面的研究。

根据基因特征，诺如病毒可分为6个基因群(Genogroup，GI-GVI)，GI 和GII 是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因群，GIV 也可感染人，但很少被检出。GIII、GV 和GVI 分别感染牛、鼠和狗。2003年Karst等人首次从免疫缺陷小鼠(RAG/STAT-/-)体内分离得到鼠诺如病毒(Murine norovirus，MNV)[3]。MNV与NoV在生物学及遗传特性方面都非常相似，可以在传代细胞如小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上生长并产生细胞病变，可以感染鼠树突状细胞和巨噬细胞。MNV是NoV理想的研究模型，在生物医学研究领域有很重要的作用。NoV许多生物学特性和感染机制都是利用MNV进行研究的。最近利用MNV，对肠道共生菌和肠道病毒在肠道免疫中起到的影响和相互作用有了全新的认识[4]。本研究采用灌胃方式感染C57BL/6实验小鼠，研究C57BL/6小鼠实验感染MNV的情况，了解MNV感染特点。

1材料与方法

1.1实验动物7只7周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠和7只8周龄雄性C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]。动物实验在中国疾病预防控制中心实验动物中心生物安全二级实验室中进行。并通过了中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所实验动物伦理委员会的审查(批准号：201511040031)。

图1　小鼠粪便检测MNV-CW1 RNA水平dpi: days post infectionFig.1　RNA levels of MNV-CW1 in feces of C57 BL/6 mice

1.2病毒MNV-CW1病毒由美国华盛顿大学医学院Herbert W. Virgin IV教授馈赠。并在RAW264.7细胞中传代增殖，细胞病变显著，病毒经反复冻融3次，低速离心后取上清，病毒滴度为104TCID50/ml。

1.3动物分组和感染途径将12只C57BL/6小鼠(包括6只雄性小鼠和6只雌性小鼠)分成两组：高剂量组和低剂量组。将MNV-CW1毒株以高剂量(104PFU/只)和低剂量(102PFU/只)分别灌胃到小鼠体内；另外同等体积的PBS灌胃到一只雄性和一只雌性小鼠体内作为正常对照。

1.4样本处理高剂量组和低剂量组小鼠感染后每天测量体温观察体表变化，收集粪便。感染后0 d、3 d、7 d和30 d采集血液，分离血清。感染后3 d、7 d和30 d，分别处死高剂量组和低剂量组雌性和雄性小鼠各一只，取心脏、肝脏、脾脏、胃、肾脏、食管、小肠、大肠和肠系膜淋巴结等器官冻存于液氮中，研究MNV-CW1的主要感染部位。解剖小鼠十二指肠放入4%多聚甲醛中，用于病理切片研究。对照组小鼠于感染后30 d处死。

1.5病毒RNA检测使用病毒核酸提取试剂盒(Viral Nucleic Acid Extraction Kit II, Geneaid)提取粪便和血清中的病毒RNA。利用匀浆机破碎组织，使用试剂盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN)提取组织中的RNA，并及时分装冻存于-80 ℃，使用Real-time PCR试剂盒(QuantiTect Probe RT-PCR Kit，QIAGEN)检测提取的RNA中病毒RNA含量。引物和探针序列参考文献设计[5]。

2结果

2.1临床观察感染病毒后，对小鼠进行了体温测量、体表和粪便形态观察。高剂量组和低剂量组小鼠一直保持正常情形，主要表现为无腹泻、体毛平顺。感染病毒后无明显体温升高现象。

2.2小鼠粪便中病毒含量测定Real-time PCR检测结果表明，高剂量组感染率达100%，在感染后第1天和第2天粪便中检测到MNV-CW1病毒RNA(图1)。低剂量组感染率为66.67%，其中两只小鼠在感染后第1天和第2天粪便中检测到病毒RNA，另外2只小鼠在感染后第2天在粪便中检测到病毒RNA。其他收集的粪便标本检测MNV-CW1病毒RNA均为阴性。

2.3小鼠血液中病毒含量测定提取0 d、3 d、7 d、30 d小鼠血清中的核酸，利用Real-time PCR检测MNV-CW1病毒RNA，只有在第3天检测到一只雌性小鼠血清中MNV-CW1阳性，含量为1.04×104拷贝。

2.4小鼠组织中病毒分布情况感染后3 d、7 d和30 d，分别处死高剂量组和低剂量组雌性和雄性小鼠各一只，取心脏、肝脏、脾脏、胃、肾脏、食管、小肠、大肠和肠系膜淋巴结等器官，提取RNA，检测MNV-CW1病毒RNA，研究MNV-CW1的主要感染部位。结果表明MNV-CW1主要感染部位为肝脏、脾脏、胃、食管、小肠和肠系膜淋巴结等器官。

2.5小鼠十二指肠病理分析感染后3 d处死的小鼠，解剖十二指肠，用于病理切片分析。结果分析与正常小鼠十二指肠组织切片相比，感染小鼠十二指肠组织切片没有明显的病理改变。

3讨论

NoVs是严重危害人类健康的重要食源性病毒，可导致不同年龄段人群的急性病毒性腹泻。对NoVs的致病机制尚不是很明确。但是NoVs在体外不能增值，而MNV却可以在传代细胞小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上生长并产生细胞病变，因此MNV成为了NoVs的替代病毒进行研究。MNV在实验动物中广泛传播，几乎所有的实验小鼠对此病毒易感[6]。本研究利用MNV-CW1感染C57 BL/6小鼠，对小鼠粪便的排毒情况和病毒血症以及组织病毒分布等做了分析。

MNV-CW1是2003年Karst等[3]首次报道发现的MNV病毒株。自然感染MNV-1的免疫缺陷小鼠STAT1-/-,STAT1-/-/PKR-/-,RAG-/-/STAT1-/-可以发生致死性感染，而野生型小鼠感染MNV后却没有发病症状。在MNV-1报道发现之后，陆续又有MNV-2、MNV-3、MNV-4等毒株被发现[7]。其中有的毒株是持续性感染，感染后8周还能在肠系膜淋巴结、脾脏、空肠和粪便中检测到病毒RNA。我们研究中用到的毒株是MNV-CW1可以造成小鼠急性感染，文献报道129和CD1小鼠感染MNV-1 1 d后肝脏、脾脏和小肠中检测到病毒RNA，2～7 d被清除[7,8]。这与我们的实验结果相符。NoVs病毒一般也是造成急性自限性感染，以轻症为主，最常见的症状是腹泻和呕吐，症状持续时间平均为2～3 d，但高龄人群和基础性疾病患者恢复较慢[9]。NoVs病毒复制主要在小肠。我们的研究表明主要在消化道和脾脏检测到MNV-CW1。下一步研究还需要在小鼠感染MNV-CW1病毒后第1天和第2天进行解剖，检测病毒基因组负链RNA在组织中的分布，以确定病毒复制部位。

本研究选用的小鼠品系是C57 BL/6。C57 BL/6小鼠基因敲除后，广泛用于病原体致病机制研究。对人类传染性疾病的研究经常借助于实验动物模型。对鼠诺如病毒MNV-CW1感染C57BL/6小鼠的研究有利于对MNV-CW1致病机制进行深入研究。

4参考文献

[1]Cremon C, De Giorgio R, Barbara G. Norovirus gastroenteritis[J]. N Engl J Med,2010,362(6):557, 557-558. doi: 10.1056/NEJMc0911723.

[2]Jones M K, Watanabe M, Zhu S, et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells[J]. Science,2014,346(6210):755-759. doi: 10.1126/science.1257147.

[3]Karst S M, Wobus C E, Lay M, et al. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus[J]. Science,2003,299(5612):1575-1578. doi: 10.1126/science.1077905.

[4]Baldridge M T, Nice T J, Mccune B T, et al. Commensal microbes and interferon-lambda determine persistence of enteric murine norovirus infection[J]. Science,2015,347(6219):266-269. doi: 10.1126/science.1258025.

[5]Kitajima M, Oka T, Takagi H, et al. Development and application of a broadly reactive real-time reverse transcription-PCR assay for detection of murine noroviruses[J]. J Virol Methods,2010,169(2):269-273. doi: 10.1016/j.jviromet.2010.07.018.

[6]Tsunesumi N, Sato G, Iwasa M, et al. Novel murine norovirus-like genes in wild rodents in Japan[J]. J Vet Med Sci,2012,74(9):1221-1224. doi: 10.1292/jvms.12-0106.

[7]Hsu C C, Wobus C E, Steffen E K, et al. Development of a microsphere-based serologic multiplexed fluorescent immunoassay and a reverse transcriptase PCR assay to detect murine norovirus 1 infection in mice[J]. Clin Diagn Lab Immunol,2005,12(10):1145-1151. doi: 10.1128/CDLI.12.10.1145-1151.200510.1128/CDLI.12.10.1145-1151.2005.

[8]Wobus C E, Karst S M, Thackray L B, et al. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages[J]. PLoS Biol,2004,2(12):e432. doi:10.1371/journal.pbio.002043210.1371/journal.pbio.0020432.

[9]Tseng C Y, Chen C H, Su S C, et al. Characteristics of norovirus gastroenteritis outbreaks in a psychiatric centre[J]. Epidemiol Infect,2011,139(2):275-285. doi: 10.1017/S0950268810000634. Epub 2010 Mar 25.

通信作者：高福，Email:gaof@im.ac.cn;段招军，Email: zhaojund@126.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.002

基金项目：中国博士后科学基金(2015M580142)

(收稿日期：2016-03-30)

Experimental infection of C57BL/6 mice with strain CW1 of murine norovirus

PangLili,JinMiao,WangHuimin,WangYing,ChenAijun,LiHuiying,ZhangQing,GaoGeorgeF.,DuanZhaojun

InstituteofMicrobiology,ChineseAcademyofSciences,Beijing100101,China[PangLL(postdoctor),GaoGF];NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(PangLL,JinM,ChenAJ,LiHY,ZhangQ,DuanZJ);BasicMedicalCollege,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010110,China(WangHM,WangY)Correspondingauthor:GaoGeorgeF.,Email:gaof@im.ac.cn;DuanZhaojun,Email:zhaojund@126.com

【Abstract】ObjectiveTo establish the animal model of infection of C57BL/6 mice by a murine norovirus (MNV) strain MNV-CW1. MethodsC57BL/6 mice were orally administrated with MNV-CW1 of 104 PFU or 102 PFU per mouse. After establishment of mice model, we observed the clinical signs of disease and detected the virus RNA in feces, serum and organs. ResultsMNV-CW1 cannot induce obvious clinical syndrome in C57BL/6 mice, such as fever, diarrhea and histophathological changes. MNV RNA was detected in fecal on day 1 or 2 after infection and the main infection sites were spleen and digestive system of mice. ConclusionsAn animal model of MNV-CW1 was established and it will provide a basis for the further study of molecular pathogenesis of MNV infection.

【Key words】Murine norovirus,MNV; mouse; experimental infection