2014年上海市手足口病的病原谱及EV-A71和CV-A16分子流行病学特征分析

甘霖　滕峥　王嘉瑜　张勇　许文波　钟照华　张曦　严冬梅



·论著·

2014年上海市手足口病的病原谱及EV-A71和CV-A16分子流行病学特征分析

甘霖滕峥王嘉瑜张勇许文波钟照华张曦严冬梅

150081 哈尔滨医科大学微生物教研室(甘霖、钟照华)； 200336 上海市疾病预防控制中心(滕峥、王嘉瑜、张曦); 102206 北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，卫生计生委医学病毒与病毒病重点实验室，世界卫生组织西太平洋区脊髓灰质炎参比实验室(张勇、许文波、严冬梅)

甘霖、滕峥对本文有同等贡献，并列第一作者

【摘要】目的研究2014年上海市手足口病的病原谱，及肠道病毒A组7l型(EV-A71)和柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)变异变迁规律。方法采集上海市2014年手足口病患者的咽拭子标本，进行核酸检测，对核酸检测结果为EV-A71、CV-A16以及其他EV阳性的临床标本进行病毒分离。对病毒分离结果阳性株进行全长VP1编码区基因的扩增以及核苷酸序列的测定和分析，然后与EV-A71、CV-A16各基因型和基因亚型的代表株构建亲缘性进化树。结果2014年上海市辖区共对2017例HFMD临床标本进行了核酸检测，共有1 644例检测结果为阳性。从中随机地选择出75份临床标本接种RD细胞和Vero细胞，共有60份出现EV特征性CPE，病毒分离的阳性率为82.67%,其中23株被鉴定为EV-A71、32株被鉴定为CV-A16、5株被鉴定为其他EV。23株EV-A71全部属于C4a进化分支；32株CV-A16中，有8株属于B1a进化分支，有24株属于B1b进化分支。 结论2014年上海市辖区手足口病呈现EV-A71与CV-A16共同流行的模式。C4a进化分支的EV-A71在上海市持续传播，而B1b进化分支成为上海市CV-A16的流行优势株。研究和掌握EV-A71和CV-A16等肠道病毒流行株的基因特征，发现其变异位点和变异趋势，对HFMD预防控制策略措施的制定将有重要的参考意义。

【主题词】手足口病；分子流行病学；肠道病毒属；柯萨奇病毒感染

Fund program: National Natural Science Foundation of China(81373049)

手足口病(hand, foot, and mouth disease，HFMD)是肠道病毒(Enterovirus，EV)引起的，儿童易感的急性肠道传染病。HFMD所引起的感染大多数为良性过程，在多数情况下是可以自愈的。少数的重症病例可发生脑膜脑炎、肺水肿、心肌炎、无菌性脑膜炎等，甚至引发重症脑干脑炎以及神经源性肺水肿，导致死亡[1]。该种疾病可由多个血清型的EV所引起，但主要病原体为柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16，CV-A16)和肠道病毒A组71型(Enterovirus A71，EV-A71)，其中由EV-A71引起的患儿多数伴有严重的并发症甚至发生死亡[2]。在1998年我国台湾地区和2008年安徽省阜阳市的HFMD暴发中，经证实，EV-A71是导致多名患儿死亡的病原体[3-5]。

HFMD是世界范围广泛流行的儿童常见的传染病，在多个国家和地区发生过暴发和流行，然而近年来以C4a基因亚型EV-A71在人群中的循环，在东南亚地区引起了大规模的暴发和流行，并引起了一定数量的重症病例和聚集性死亡病例。上海市是我国HFMD病的高发地区之一，在1981年上海市报道了26例临床诊断为HFMD的病例，在2002年也有HFMD暴发的报道[6]。本研究对2014年上海市HFMD的病原谱进行了研究，并对其中两种主要病原体(EV-A71和CV-A16)的基因特征及其流行和传播规律进行了分析，为有效地防治HFMD提供了一定的实验室依据。

1材料与方法

1.1标本采集与对象标本的采集对象为2014年上海市辖区内被临床诊断为HFMD的患儿。使用专用的采样棉签，采集患者自发病起3 d之内的咽拭子标本，放入装有3～5 ml标本保存液的无菌采样管中，并且于4 ℃暂时存放，在12 h之内被送达实验室等待检测。

1.2病毒RNA的提取和血清型别鉴定将咽拭子标本在标本保存液中充分地搅动，在4 ℃条件下，进行10000 rpm的离心20 min，吸取上清液。根据《手足口病防控指南(2012)》的要求，进行EV-A71、CV-A16和其他EV的核酸检测。用BioFlux Simple P Total RNA Extraction Kit进行总RNA提取，具体的操作步骤详见试剂盒的说明书。然后用实时荧光-逆转录-聚合酶链反应(Real time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, rRT-PCR)的方法对病毒的核酸进行EV-A71、CV-Al6和其他EV的鉴定[7]。

1.3病毒分离将核酸检测结果为EV-A71、CV-A16和其它EV阳性的咽拭子标本，接种于人横纹肌肉瘤(RD)细胞和非洲绿猴肾(Vero)细胞，接种量为200 μl。接种后于温度为36 ℃、CO2浓度为5%的细胞培养箱当中进行培养。当连续培养2代之后，无EV特异的致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，判为阴性；如果有CPE，终止培养，于-20 ℃冰箱冻存。

1.4EV-A71和CV-A16全长VP1区扩增应用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)对EV-A71和CV-A16的全长VP1编码区的891个碱基对(base pair, bp)的片段进行扩增，扩增的引物分别为EV71-VP1-S与EV71-VP1-A[8]、CVA16-VP1-S与CVA16-VP1-A[9]，由国家脊灰实验室设计，使用浓度100 μg/ml。

采用日本TaKaRa One Step RT-PCR Kit Ver2(Cat#RR057A)进行RT-PCR反应。反应的条件为：50 ℃ 30 min进行逆转录反应，94 ℃ 2 min灭活逆转录酶；扩增的反应条件是94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，32个循环；最后进行72 ℃10 min的延伸后结束反应。用1.7%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行结果分析。

1.5核苷酸序列测定RT-PCR扩增后的阳性产物用QIAquick PCR purification kit(Qiagen，Valencia，美国)进行纯化。然后分别地使用其RT-PCR的上下游引物和BigDyeTMTerminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction Kit(Applied Biosystems，美国)试剂进行双向标记反应，标记的反应条件遵照该试剂盒的使用说明书。标记后的产物在经过葡聚糖凝胶G-50(Pharmacia，瑞典)的纯化后，于ABI 3730XL型序列测定分析仪上(Applied Biosystems，日本)进行自动测序和分析。

1.6生物信息学分析采用软件Sequencher 5.0(GeneCode, Michigan, USA)进行序列的拼接与比对，拼接后的序列通过与基因数据库(GenBank)中已发表的序列进行BLAST比对确定其血清型[10]。使用软件MEGA 5.1，并采用邻接法(neighbor-joining)系统进行发生树的构建，采用Kimura 2-parameter model的模型，建树的可靠性通过1000 bootstrap来进行评估[11]。

2结果

2.12014年上海市辖区手足口病病原谱2014年上海市辖区共报告64 690例HFMD，其中轻症为64 486例，重症为201例，死亡3例。使用rRT-PCR的方法对全部重症和死亡病例和部分轻症病例共3 006例进行了核苷酸检测，共有2 187例的检测结果为阳性，阳性率为72.8%。对其中1 746例进行EV-A71、CV-A16的双通道rRT-PCR检测，检出EV-A71阳性病例556例(32.4%)，CV-A16阳性病例737例(42.2%)，其他EV阳性病例443例(25.4%)。在检测的1 554例轻症HFMD病例中，病原谱构成为：EV-A71阳性384例(24.7%)，CV-A16阳性732例(47.1%)，其他EV阳性438例(28.2%)；在检测的201例重症HFMD病例中，检测阳性的有190例，病原谱构成为：EV-A71阳性180例(94.7%)，CV-A16阳性5例(2.6%)，其他EV阳性5例(2.6%)；在检测的3例死亡HFMD病例中，有2例检测结果阳性，鉴定为EV-A71。

随机选择EV-A71、CV-A16和其他EV核酸检测阳性的HFMD标本75份(包括HFMD轻症病例标本65份，HFMD重症病例标本10例)，接种RD细胞和Vero细胞，有60份(全部都是轻型病例标本)在两种细胞上出现EV特征性CPE，病毒分离阳性率为82.67%。其中23株鉴定为EV-A71，32株鉴定为CV-A16，5株鉴定为其他EV。核酸检测和病毒分离的实验室检测结果都表明，2014年上海地区HFMD的病原谱呈现EV-A71与CV-A16共同流行的模式。

2.2C4a进化分支的EV-A71在上海市持续传播对23株EV-A71进行全长VP1区扩增，并进行了核苷酸序列分析，结果显示23株EV-A71的VP1区核苷酸序列的长度为891个核苷酸，编码297个氨基酸。采用MEGA5.1软件的Neighbor-Joining法，构建23株上海市EV-A71分离株与全球EV-A71各基因型和基因亚型代表株的亲缘关系树，以CV-A16原型株(G-10株)作组外对照株(图1)。

“●”表示2014年上海市EV-A71株图1　基于各个基因型EV-A71的全长VP1区的进化树“●”indicates the EV-A71 strains in Shanghai, 2014Fig.1　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of each genotype of EV-A71

“●”表示2014年上海市EV-A71株;“▲”表示2008年上海市EV-A71株;“△”表示2009年上海市EV-A71株;表示2010年上海市EV-A71株;表示2011年上海市EV-A71株;“◆”表示2012年上海市EV-A71株图2　上海市2008-2014年EV-A71分离株与我国其他省份的EV-A71代表株的VP1区核苷酸序列的进化树 “●”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2014; “▲”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2008;“△”indicates the EV-A71 strains in Shanghai in 2009; “■”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2010; “□”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2011; “◆”indicating the EV-A71 strains in Shanghai in 2012Fig.2　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of EV-A71 from Shanghai Municipal in 2008-2014 and other provinces in China

从进化树图中可以看出，根据EV-A71的VP1区的核苷酸序列差异，EV-A71被划分为七个基因型，即A、B、C、D、E、F和G基因型，各型间差异在16.5%～19.7%之间，各个基因型内部之间的核苷酸序列差异小于12%。根据亲缘关系，将各基因型进一步划分为不同亚型，其中A基因型中只有EV-A71的原型株——BrCr株，其B基因型又进一步地被分为从B0-B7的7个基因亚型，其C基因型又进一步地被分为从C1-C6的6个亚型。从图1可见，23株EV-A71与C4a基因亚型代表株在同一分支内，bootstrap值高达100，说明上海流行的EV-A71属C4a基因亚型。进一步分析发现，C4a进化分支中，23株EV-A71处于不同簇，揭示上海市EV-A71流行有多个传播链。

对2008～2014年从上海市分离到的EV-A71的VP1编码区的核苷酸序列进行比对分析，不同年份间的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为95.9%～97.5%、99.34%～99.41%。进化树的分析结果表明：上海市2008～2014年的EV-A71分离株在进化上均属于C4a进化分支，EV-A71-C4a在上海市持续传播(图2)。EV-A71在传播过程中不断进化，各年代毒株间遗传距离逐渐增大。

2.3B1b进化分支成为上海市CV-A16流行优势株对32株CV-A16进行全长VP1区扩增，并进行核苷酸序列分析，结果显示32株CV-A16的VP1区核苷酸序列的长度为891个核苷酸，编码297个氨基酸。采用MEGA5.1软件的Neighbor-Joining法，将32株上海CV-A16分离株与世界CV-A16各基因型和基因亚型代表株构建亲缘关系树，以EV-A71的原型株(BrCr株)作为组外对照(图3)。

从进化树图中可以看出，根据CV-A16的VP1区的核苷酸序列差异，CV-A16划分为两个基因型，即A和B基因型，两型间差异在16.5%～19.7%之间，各个基因型内部之间的核苷酸序列差异小于12%。根据亲缘关系，将各基因型进一步划分为不同亚型，其中A基因型只有CV-A16的原型株——G-10株，B基因型又进一步分为B1-B2基因亚型。8株CV-A16与B1a进化分支的代表株处于同一分支，且bootstrap值为100，并处在不同簇(Lineage 1和Lineage 2)中，说明上海市B1a进化分支CV-A16至少存在两个传播链，Lineage 1和Lineage 2之间的核苷酸序列平均同源性为92.4%。24株CV-A16与B1b进化分支的代表株处于同一分支，且bootstrap值均>85，并且也可以进一步地分为两个不同的小簇(Lineage 3和Lineage 4)，Lineage 3为上海市2014年CV-A16流行的优势分支，共计28株，核苷酸的同源性、氨基酸的同源性分别为93.83%～100%和98.64%～100%；Lineage 4，共3株，核苷酸的同源性、氨基酸的同源性分别为98.32%～98.88%和100%。Lineage 3和Lineage 4之间的核苷酸序列平均同源性为92.2%。以上结果说明上海CV-A16的流行存在多个传播链。

3讨论

HFMD是由多种EV引起的常见儿童传染病，并且是主要以EV-A71和CV-A16做为该病的病原体。人们最早发现手足口病的病原体是CV-A16，后来被发现的柯萨奇病毒A组的4型、6型、10型以及B组的4型和5型等EV也可引起HFMD[12,13]。自从EV-A71于1969年首次被分离到以来，人们逐渐地认识到EV-A71也可以成为HFMD的主要病原体。因此，在目前缺乏广泛有效的疫苗和特异性的治疗药物的情况下，对导致手足口病的两种主要病原体CV-A16和EV-A71进行流行病学监测及病原学监测具有重大意义[14]。

分子流行病学的研究结果已经对我国流行的EV-A71的基因特点、流行和传播规律进行了初步的阐明，中国大陆的EV71的分子流行病学，实际上就是一部C4基因亚型EV-A71的进化史。自1998年以来，中国大陆流行的EV-A71全部属于C4基因亚型，并且出现了不同的进化分支更替，由很少引起HFMD重症和死亡病例的C4b进化分支(流行于1998-2004年间，目前在我国已经消失)，演变为引起较多重症和死亡病例的C4a进化分支(自2004年出现流行至今，推测其神经毒力由于持续进化而升高)[8,15]。

自1998年以来，C4亚型为上海市的绝对优势型别；随着EV-A71在我国的持续流行和传播，C4亚型已进化为C4a和C4b，上海2000年首次检出C4b进化分支EV-A71，自2004年C4a进化分支EV-A71取代C4b进化分支，成为上海市流行的绝对优势基因亚型。基于对上海市EV-A71 VP1编码区分子流行病学的分析，得出上海市2014年流行的EV-A71与我国其他地区EV-A71同属于大陆2004年以来流行的优势基因亚型C4a。2008年以来HFMD突发大流行并非因新病毒或新亚型病毒输入造成，推测C4亚型病毒的进化为可能原因之一，但是仍需进一步的证实。EV-A71在传播过程中不断进化，各年代毒株间遗传距离逐渐增大。而EV-A71流行株基因特征、核苷酸变异、氨基酸变异及趋势，对EV-A71疫苗免疫效果后期评价有重要参考意义。

“●”表示2014年上海市CV-A16株图3　基于各个基因型CV-A16的全长VP1区的进化树“●”indicating the CV-A16 strains in Shanghai, 2014 Fig.3　Phylogenetic tree based on the entire VP1 coding region of each genotype of CV-A16

Perera等根据CV-A16的VP1编码区815nt核苷酸序列资料，将CV-A16划分为A、B两个基因型，其中B基因型又可以被划分为B1、B2两个基因亚型[16]。在之后张勇等人的研究中，将CV-A16的B1基因亚型进一步地划分为B1a、B1b、B1c三个进化分支[9]。本研究中，2014年在上海市分离到的32株CV-A16毒株全部属于B1基因亚型中的B1a和B1b进化分支，其中B1b进化分支为优势流行基因亚型。

近年来，由多个血清型EV导致的手足口病在我国儿童中广泛传播并有较大的暴发流行，本研究对上海市2014年HFMD的流行病学与病原学进行了分析，发现EV-A71的C4a亚型和CV-A16的B1b亚型的流行对2014年上海市HFMD的疫情影响较大，但是EV-A71是导致手足口病重症和死亡的绝对优势病原。因此我国强化手足口病的监测，对EV-A71疫苗上市后的使用具有很重要的科学指导意义。研究和掌握EV-A71和CV-A16等肠道病毒流行株的基因特征，发现变异位点和变异趋势，对HFMD预防控制策略措施制定将有重要的参考意义。

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通信作者：钟照华，Email:zhonghmu@gmail.com；张曦， Email:.zhangxi@scdc.sh.cn；严冬梅，Email:dongmeiyan1976@163.com

DOI：10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.03.008

基金项目：国家自然科学基金(81373049)

(收稿日期：2016-01-23)

Pathogen spectrum of HFMD and molecular epidemiology of EV-A71 and CV-A16 in Shanghai, 2014

GanLin,TengZheng,WangJiayu,ZhangYong,XuWenbo,ZhongZhaohua,ZhangXi，YanDongmei

DepartmentofMicrobiology,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China(GanL,ZhongZH);ShanghaiCenterforDiseaseControlandPrevention,Shanghai200336,China(TengZ，WangJY，ZhangX);WorldHealthOrganizationRegionalOfficefortheWesternPacificRegionalReferencePolioLaboratoryandKeyLaboratoryofMedicalVirology，NationalHealthandFamilyPlanningCommissionofthePeople’sRepublicofChina,NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China(ZhangY,XuWB,YanDM)GanLinandTengZhengarethefirstauthorswhocontributedequallytothearticleCorrespondingauthors：ZhongZhaohua，Email:zhonghmu@h126.com；ZhangXi，Email:zhangxi@scdc.sh.cn；YanDongmei，Email:dongmeiyan1976@163.com

【Abstract】ObjectiveTo study the pathogen spectrum of HFMD and the rules of variable of EV-A71 and CV-A16 in Shanghai Municipality in 2014. MethodsNasopharyngeal swabs were collected from HFMD patients in Shanghai Municipality in 2014, and viral RNA detection was performed. Viral isolation was performed on the specimens with the positive RNA detection for EV-A71, CV-A16 and other EVs. Entire VP1 coding region amplification was performed and sequencing analysis was determined. Phylogenetic trees were constructed based on the entire VP1 sequences of all known genotypes and sub-genotypes of EV-A71 and CV-A16. ResultsIn 2014 in Shanghai Municipality, a total of 2017 clinical specimens collected from HFMD patients were tested, and 1644 were positive for EV-A71, CV-A16 and other EVs. 75 specimens were randomly selected to inoculate onto RD cell and Vero cell, and there were 60 specimens appeared special EV CPE with the positive rate of 82.67%. Among them, 23 strains were identified as EV-A71, 32 strains were identified as CV-A16, and 5 strains were identified as other EVs. 23 EV-A71 strains all belonged to C4a sub-genotype; and among 32 CV-A16 strains, 8 strains belonged to B1a sub-genotype, and other 24 strains belonged to B1b sub-genotype. ConclusionsEV-A71 and CV-A16 co-circulated in Shanghai Municipality in 2014. C4a sub-genotype of EV-A71 continued to spread in Shanghai, and B1b sub-genotype of CV -A16 became predominant CV-A16 strains in Shanghai. For the HFMD prevention and control strategy, it is important to investigate the genetic characteristics of the epidemic, such as EV-A71, CV-A16 and other EVs.

【Key words】Hand, foot and mouth disease; Molecular epidemiology; Enterovirus; Coxsackie virus infections