浓缩细胞生长因子在整形美容外科中的应用

王 昕, 陈小平, 林金德



综 述

浓缩细胞生长因子在整形美容外科中的应用

王 昕, 陈小平, 林金德

细胞生长因子； 面部年轻化； 骨缺损修复

浓缩细胞生长因子(concentrated growth factors, CGF)是通过专用特殊设备，将自体外周血经不间断差速离心制备而成的富含多种高浓度生长因子的血液提取物[1-7]，其可促进组织修复和再生，在整形美容外科领域有广阔的应用前景。笔者就CGF的发展简史、制备方法、生物学功能、临床应用和展望综述如下。

1 CGF技术的发展历史

20世纪80年代，学者们根据全血中各种成分沉降系数的不同，利用离心的方法从外周全血中分离出富含高浓度血小板、白细胞、纤维蛋白原和细胞生长因子的血液提取物，用于创伤修复和促进组织再生[8-9]。由于分离方法不同，所得到的血液提取物内含有的有效成分和数量也有所不同。1984年，RK Assoion等采集自体外周全血并加入抗凝剂后，通过恒速(后改为二次梯度)离心方法，首先提取了富含血小板(血小板数为外周血的4倍以上)的富血小板血浆(platelet-rich plasma， PRP)。当PRP与氯化钙以及牛凝血酶混合后，各种生长因子即从血小板中的α颗粒中释放出来。但是，牛凝血酶的使用往往伴随着凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗体的形成，存在着发生凝血功能紊乱的可能性。2001年，J Choukroun采用外周全血直接离心而不添加任何生物制剂的方法，获取了富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin, PRF)[10]；仅需抽取外周全血放入硅基玻璃离心管后，迅速将其低速离心即可获得凝胶状PRF，分子结构类似于天然血凝块。由于离心分离制备过程中无抗凝剂，仅借助玻璃离心管中的硅元素，促成了血小板激活与纤维蛋白的生理性聚合，开启了生理凝血过程的模式，收集到天然凝血块和激活血小板胞吐α颗粒释放出大量蕴含的重要细胞生长因子。在细胞生长因子的调节作用和纤维蛋白的支架作用下能促进组织修复和再生。与PRP比较，PRF制备时同样采用自身血液通过恒速离心法提取，但无任何生物制剂的添加，对正常人体生理功能无干扰。2006年，L Sacco首先采用特殊的专用离心设备制备出CGF[2]，与PRF一样，CGF是通过不抗凝的外周血分离制备而成。不过，两项技术的离心速度和离心方法有所不同。PRF以400 g(3000 r/min)离心力恒速离心10 min而获取，CGF则采用不间断差速(2400～2700 r/min)离心13 min后获得。CGF在制备的过程中，除了不添加任何生物制剂外，还需要利用专用设备及其特殊的高低转速离心方式，使血小板受到撞击后释放出更多的细胞生长因子[1-7]，而纤维蛋白的拉伸强度及黏合度也均高于定速离心机所制备出来的PRF凝胶。这不仅提高了CGF促进组织细胞的迁移、增殖和分化能力，同时增强了修复组织与器官的再生能力。

2 CGF制备的专用设备与方法

目前,CGF是通过Medifuge离心机(SILFRADENT，意大利)离心全血而获得，其具备特定的CGF程序即变速离心技术，该程序具有以下特点：加速30 s，速度达到2700 r/min；旋转2 min后，降到2400 r/min；旋转4 min，加速到2700 r/min;旋转4 min，加速到3300 r/min；旋转3 min，减速至36 s停止[2]。该设备除具有特殊的加速、减速离心全自动程序化系统外，还有精确的温控系统，可以保证提取CGF时的环境温度。这种不间断差速离心可以激活血小板，启动生长因子的分泌，胞吐α颗粒释放细胞生长因子，同时还可避免血液中的生长因子被破坏。而制备出的CGF纤维蛋白较定速离心机制备的PRP及PRF拉伸强度更高，黏结强度更强，所含血小板衍生生长因子(PDGF)、转移生长因子-β(TGF-β)、类胰岛素生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)以及成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形成蛋白(BMPs) 等生长因子含量更多。而且10 min内，细胞生长因子释放就可以达70%，1 h之内接近100%；生长因子全部被释放出来需要1周时间。CGF制备的具体操作：Vacuette负压真空采集管(Medifuge离心机特殊匹配试管)抽取患者的自身静脉血9 ml，立即置入Medifuge离心机；设定CGF制备程序，离心13 min后，可见试管中血液分为3层。血液在离心过程中，由于红细胞沉降速度最快，离心后沉入试管底层；CGF、白细胞和血小板沉降速度相似，但慢于红细胞，故沉积在中层；最上层淡黄色为贫血小板血浆(platelet-poor plasma， PPP)。制备结束后可立即得到液态CGF，并可用于面部皮肤注射，改善皮肤质地。放置后可获得CGF凝胶。弃除上层血浆，用无菌剪刀自中间层及底层交界处剪开，并用各种专用工具将中间层CGF压制成膜(创面覆盖)，与自体骨颗粒复合(骨创腔填充)，修剪CGF膜至颗粒直径1～3 mm与自体脂肪复合(脂肪填充移植)，用于各种特殊用途的组织修复。

3 CGF的生物学功能

CGF的主要成分为丰富的血小板、白细胞，外周血干细胞和高浓度的各类生长因子及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架。CGF 具有刺激多种细胞增殖和分化的生物功能，其作用的发挥除了有赖于其高浓度的各类生长因子及纤维蛋白原所形成的纤维网状支架外，还依赖于富含的血小板、白细胞和外周血干细胞等。主要功能：⑴细胞生长因子的调节作用。在制备CGF过程中，特殊的变速离心使血小板被激活，血小板胞吐α颗粒释放出各种生长因子，这些细胞生长因子通过与细胞膜上相应的受体相结合，激活下游信号通路，将信号传至核内，促进细胞增殖、基质合成和血管生成。⑵纤维蛋白形成的支架结构。生物材料的生物学性能取决于材料的组成与空间结构。当自体全血的凝血机制被触发后，纤维蛋白原转化为纤维蛋白多聚体成为凝血块的基质成分，并在离心过程中将接近全部的血小板、超过半数的白细胞、血循环中散在的小分子活性物质(细胞因子等)网罗于新形成的凝血块中，纤维蛋白作为一种基质为细胞的附着、迁移以及分化提供了有利的场所。CGF在离心分离过程中，由于纤维蛋白原分子的聚合，纤维蛋白块可组成三维聚合物。CGF纤维蛋白分子结构为三键式联结，呈立体网状结构，可有效地滞纳血小板及各种循环分子(如细胞因子)。而纤维网状支架又能支持生长因子所诱导生成的新生组织，使修复细胞、红细胞、白细胞、血小板及抗体易于迁移和增殖。⑶炎症调节。纤维蛋白聚合形成的网状结构内有大量白细胞、免疫细胞和免疫调节因子，如白细胞介素(IL-1β，IL-6，IL-4)、肿瘤坏死因子(TNF-α)等存在，使CGF具有一定的免疫防御与局部抗炎功效，能减轻创伤后的炎症反应，促进组织修复。⑷引导循环血中干细胞的迁移、增殖和分化。纤维蛋白网状结构是CGF的基质支架，有趋化作用，可募集血循环中的干细胞；支持细胞迁移，促进细胞黏附。在CGF内有大量CD34阳性细胞[2]，表明其基质内有外周血造血干细胞存在，可促进组织再生和分化。⑸止血。血小板具有凝血和止血的重要功能，它参与生理性止血的全过程。当血管壁受损时，它能迅速在血管受损部位形成止血栓，迅即发生变形，使表面黏度增大，凝聚成团。一般通过黏附、释放、聚集、收缩、吸附等步骤来完成其止血的生理功能。可见，其在机体的出凝血和炎症反应过程中具有重要作用。

4 CGF的临床应用

4.1 伤口愈合 创面愈合是生物体与生具有的自然生物学属性，是一个复杂而有序的生物学过程，主要包括炎性介质反应、细胞增殖/结缔组织形成、创面收缩和创面重塑几个阶段。创面愈合的复杂病理、生理过程涉及炎细胞、修复细胞、细胞外基质和细胞因子等诸多环节的相互作用，任一环节受抑，都会影响愈合的速度和质量。难愈创面的出现是自然修复过程的停滞甚至恶化，其特点为：⑴常有血运不良的深部组织外露，如骨组织、肌腱或腱膜组织。⑵常有异物、坏死组织残留或潜腔形成。⑶创面周围组织血流循环不良、缺血缺氧或瘢痕形成。⑷常伴有病原菌感染，特别是耐药菌感染。近年来在难愈性创面的临床治疗中，随着对创面修复机制的深入研究，局部细胞生长因子数量减少，活性降低或多种生长因子网络调节失控也是创面难愈的原因之一，因此，细胞生长因子在促进创面愈合中的应用也越来越多[11-13]。过去用细胞生长因子在难愈创面的治疗中使用单一因子治疗的比较广泛，也取得了比较好的效果。但研究证实，在创面愈合的不同阶段，各类生长因子的产生量、受体活性和作用并不是完全同步的，各因子之间具有协同作用。PRP、PRF和CGF都含有高浓度各种生长因子。这些细胞生长因子对创面的愈合起着非常重要的作用，因各生长因子的比例与体内正常比例相似，并具有最佳的协同作用，在一定程度上弥补了单一生长因子治疗的缺点。PRP、PRF和CGF是治疗慢性溃疡最有前途的治疗方法。这类治疗已被应用于具有各种基础疾病(糖尿病、外周动脉疾病、皮肤结节性多动脉炎)患者的慢性足部溃疡[14]、常规治疗失败的胸外科手术裂开伤口[15]、硬腭创口不能直接关闭的创面并获得成功[16]，尚未发现局部或全身的并发症。基于此，对慢性溃疡患者的治疗进入了一个新时代。

4.2 面部年轻化 面部老化表现为皮肤质量下降、皮下软组织萎缩以及面部组织松弛和移位等。面部年轻化的治疗主要有面部除皱、面部皮肤抗老化、脂肪及生物材料填充等。研究表明，老化的皮肤厚度变薄、弹性降低、失去光泽、出现皱纹及色斑等。CGF在皮肤抗衰老中的作用主要是：多种高浓度生长因子被激活后，可引起衰老受损皮肤组织产生一系列抗衰老反应，如抵抗DNA合成抑制因子，促发相应的基因表达而起作用。另外，CGF成分中含有的纤维素纤粘连蛋白及亲玻粘连蛋白，将血小板释放的生长因子聚集在局部而发挥作用，还能作为新生细胞和组织支架促进衰老皮肤的修复。应用细胞生长因子可诱导皮肤胶原沉积，使血管再生和脂肪形成，增加皮肤光泽、恢复皮肤弹性及饱满度[17-20]。Sclafani[20]将富含细胞生长因子的PRF注射于患者鼻唇沟的皮下组织，术后2周，可出现明显的嫩肤治疗效果；随访3个月，患者的面部皮肤弹性及饱满度仍保持良好。自体颗粒脂肪移植也用于改善面部轮廓的老化，但是，移植脂肪不可能全部存活，术后有部分移植脂肪出现吸收，其远期效果的不确定性成为脂肪移植的最大缺陷。一般来说，脂肪移植后吸收率为20%～90%(RA Ersek, 1991年)。脂肪移植的成活与多种因素有关，如供区因素、受区因素、脂肪抽吸方法的选择和辅助用药等。要提高移植脂肪的成活率，首先要促进移植脂肪细胞与受区建立血供，其次是抑制脂肪细胞分解，促进前脂肪细胞的增殖分化，促进移植体内纤维组织的增生，因此，才能保证移植体的最终体积，起到脂肪移植填充组织的作用。Liu等[21]发现，PRF以其富含具有调节组织修复能力的血小板及其活化后释放的多种细胞因子的特点，可有效地促进移植脂肪血管化，延缓或抑制移植脂肪细胞的凋亡，提高移植脂肪成活率。富含生长因子的PRP、PRF与自体颗粒脂肪混合移植，能够提高移植脂肪的存活，明显减少淤斑和脂肪吸收[22-23]。细胞生长因子可加速移植脂肪早期的血管重建并抑制脂肪细胞凋亡坏死，从而达到移植脂肪成活率的提高。2007年，F Braccini和DM Dohan将PRF与颗粒脂肪复合用于32例面部脂肪移植，由于脂肪吸收很少，1次治疗后，患者对疗效非常满意，未出现因脂肪吸收而需要2次再注射脂肪的情况。 Keyhan等[24]采用自身对比的方法，对PRF与PRP混合颗粒脂肪注射填充面颊部和颧颊部进行了比较，结果表明PRF比PRP更适合与颗粒脂肪复合用于面部脂肪移植，因为PRF比PRP作用更稳定和持久，一旦聚合形成，其硬度如人类完整皮肤一般，其支架结构能够抵抗生理压力，留存更长久。Rodella等[2]检测发现，CGF内除了有大量细胞生长因子外，还含有CD34阳性细胞，这意味着CGF中有外周血干细胞的存在，能促进前脂肪细胞向脂肪细胞转换。

4.4 皮片与皮瓣移植 皮肤移植术主要包括皮片移植和皮瓣移植，是整形美容外科修复创面的基本术式。移植皮片的存活有3个关键步骤：⑴可靠的固定。皮片易滑动移位以至无营养来源而坏死。⑵皮片与受植床的适宜结合。皮片与受植床基底部应密切接触，贴合不紧可影响皮片成活；压力过大则血管向皮片生长受阻碍，也会造成皮片坏死。⑶成熟(有效的血供建立)。在一个单中心随机对照持续9个月的前瞻性研究中，Waiker 等将200例创伤植皮患者分为两组。实验组将自体富含细胞生长因子的PRP应用于移植床黏合皮片，对照组则采用常规方法缝合固定皮肤移植皮片于创面[27]。其结果：PRP组的移植区血肿、受区肿胀、敷料更换次数和住院时间等都低于对照组，而且还能减轻植皮供区疼痛[28]。细胞生长因子可促进植皮创面血管生成和Ⅰ型胶原的沉积[14]，如果用于皮瓣受区，能促进皮瓣的血管化，提高皮瓣的成活率[29]。

4.5 脱发与发移植 脱发从古至今一直存在治疗上无理想方法。随着细胞生长因子的应用，使得部分生发无望的患者在脱发区长出新头发，可见，细胞生长因子具有诱导毛乳头细胞增殖的生发作用[30-32]。Singh[30]将PRP注入慢性斑秃的头皮病损区，间隔4周再注射，共治疗6个疗程。结果20例患者都有新发生长，除1例复发外，无任何不良反应。Gkini等[31]用PRP对20例脂溢性斑秃患者进行冲击治疗，脱发减少，3个月内达到正常水平，其头发密度在3个月时达到高峰；6个月和1年时，相对于治疗前头发明显增加，无明显的不良反应，患者满意。尽管还没有看到细胞生长因子在植发上的应用，但相信CGF技术一定会推动毛发移植技术的不断革新。

5 展望

CGF与RPR和PRF一样在本质上都是富含血小板、白细胞、纤维蛋白原和细胞生长因子的血液提取物。CGF的制作原理和PRF 相同，但是，CGF通过特定的程序来改变离心转速，从而更好地富集生长因子和蛋白纤维。与PRF比较，CGF 能获取更致密的纤维凝胶及浓度更高的生长因子[1-7]。其优点：⑴CGF是自源性的，这从根本上避免了外源性生长因子引起免疫排斥、传播疾病以及异种重组基因产品，可能改变人类遗传结构的担忧。另外，在制备过程中不添加任何生物化学制剂，安全可靠。⑵CGF含有大量的纤维蛋白，可以黏合骨折块和填充骨腔，为修复细胞提供良好的支架。⑶CGF制备成胶状覆盖创面，不仅提供了湿润的环境，有利于伤口愈合生长，还可以使生长因子长时间局限作用于伤口处，避免了目前广泛应用于临床的液态重组生长因子试剂在伤口易流失、易蒸发的缺点。⑷CGF中还含有大量高浓度的白细胞，可以防止感染发生。⑸CGF可减轻术后出血及疼痛，减少术后并发症。⑹CGF制作简单，对患者创伤小；约15 min即可完成。

鉴于CGF具有的多种细胞增殖和分化作用以及促进组织再生与修复的独特优势，其生物学功能正在被人们逐步认识，在抗衰老与面部年轻化、创伤修复(慢性溃疡、大面积撕脱伤，组织缺损、骨移植等)、皮片移植和皮瓣成活、生发和植发等整形美容外科领域有望出现重大突破。

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210029 江苏 南京，南京医科大学附属友谊整形外科医院 整形美容科

王 昕(1974-)，女，黑龙江哈尔滨人，副主任医师.

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.05.020

2015-11-28)