自体脂肪基质血管成分改善植皮效果的初步临床实验研究

毛曦媛 李华 程辰 李青峰

论著

自体脂肪基质血管成分改善植皮效果的初步临床实验研究

毛曦媛 李华 程辰 李青峰

目的 在植皮术中辅以自体基质血管成分（stromal vascular fraction，SVF）进行治疗，观察其植皮效果的改善情况。方法 于植皮术同时行脂肪抽吸术，取得患者自体脂肪组织，通过胶原酶消化后提取SVF；植皮区行患者自身对照，实验组植皮区皮下注射SVF（1×105cells/cm2），对照组注射等量生理盐水；术后1个月、3个月、6个月及12个月随访，观察皮片弹性、色泽、质地及回缩率。结果 2014年4月至2015年12月，共18例患者。SVF辅助植皮实验组和对照组均未出现皮片存活不佳、坏死（P＞0.05）。随访结果显示：术后6个月和12个月，实验组较对照组色泽更接近取皮区正常皮肤（P＜0.05）；术后3个月和6个月，实验组含水量均明显高于对照组（P＜0.05）；术后3个月、6个月和12个月，实验组皮片摩擦力均明显低于对照组（P＜0.05）；术后3个月、6个月和12个月，实验组皮片弹性优于对照组（P＜0.05）；术后1个月和3个月，实验组的皮片回缩率明显低于对照组（P＜0.05）。结论 SVF辅助皮片移植可有效改善皮片色泽和质地，明显减少皮片回缩，是一种安全有效的方法。

基质血管成分 皮片移植 皮片回缩

修复皮肤缺损的方法主要有皮片移植与皮瓣移植。皮片移植成功率高，操作简便，对供区损伤小，但是存在术后回缩、皮肤色素沉着、质地僵硬等问题，不适用于功能部位及影响美观的部位；皮瓣虽然没有皮片的这些缺点，但皮瓣存在供区损伤大，手术难度高，并且皮瓣术后常较臃肿，需进行后期修整。皮片移植后效果不佳主要是因为皮片回缩和皮片质地改变，可能与皮肤胶原蛋白及皮下脂肪缺失有关。

脂肪是重要的皮下组织成分，对皮肤有支持营养等作用，脂肪组织中含有大量多能间充质干细胞，即脂肪来源干细胞 （Adipose-derived stem cells，ASCs），能够分化为中胚层来源的多种组织细胞［1］，促进组织再生、创面愈合及血管新生［2］。此外，ASCs还能分泌多种细胞因子［3］。

ASCs体外分离培养和临床应用，尚存在技术问题和相关的伦理问题，限制了ASCs的临床应用。

基质血管成分 （Stromal vascular fraction，SVF）最早由Rodbell和Jones发现报道［4］，是脂肪组织经过胶原酶消化和离心以后得到的细胞沉淀，它是富含脂肪来源干细胞的复合细胞群，其中包括ASCs、血管内皮细胞、多种血细胞等细胞成分［5］，已在多项临床实验中得到应用［6-7］。SVF最主要的优点就是获取简便，无需体外培养，分离后就可直接利用。SVF被证实具有促进组织再生、愈合、血管化的能力［8］。

为了观察SVF是否能改善皮片移植的效果，我们在前期动物实验中利用SVF辅助皮片移植，观察到早期皮片血供增加、皮片存活率增高；远期皮片回缩率降低、皮片质地改善；组织学观察到皮片下胶原组织增多、多种促血管生成的细胞因子分泌增加。这些结果提示，SVF辅助皮片移植能有效改善皮片移植的效果［9］。

为了进一步观察SVF辅助皮片移植在临床应用中的效果，我们进行自身对照的临床实验，在植皮同时辅助自体脂肪SVF移植，术后随访，观察皮片弹性、色泽、质地及回缩率，评价SVF辅助皮片移植对皮片移植效果的改善作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

注射用胶原酶 （上海乔源生物制药有限公司），盐酸利多卡因注射液（丽珠集团利民制药厂），盐酸肾上腺素注射液 （东北制药集团沈阳第一制药有限公司）。

Cutometer dual MPA 580皮肤测试仪（Courage+Khazaka，德国），恒温摇床 （太仓市华美生化仪器厂），离心机（Thermo Scientific，美国），离心管（BD，美国），40 μm滤网（BD，美国），10 mL移液管（Corning，美国），通用移液管（Thermo Scientific，美国）。

1.2 伦理审议及患者知情同意

本实验通过我院伦理委员会伦理审议 ［沪九院伦审（2014）20号］。术前告知患者实验目的、实验内容、可能出现的情况及处理原则，患者表示理解并签署知情同意书。

1.3 病例招募

病例纳入标准：①双侧对称部位或者同一部位多处行植皮术患者，一侧为对照组，不加干预；一侧为治疗组，给予SVF干预；或一侧肢体上多个手指植皮术患者，随机选择其中部分手指进行干预，其余手指为对照组；②身体健康无基础疾病；③有良好的供皮区，同一供皮区能满足多处创面修复。

病例排除标准：①不适合行皮片移植者，或供皮区存在不适宜切取皮片者，如感染、血运障碍、延期愈合史、软组织活力下降、放疗史或将接受放疗、活动性溃疡等；②合并严重内科疾病（如糖尿病、肝炎、冠心病、动脉硬化、肾小球肾炎、自身免疫性疾病等），或存在心、肺、肝、肾功能不良，经外科医生评定不能够耐受手术风险者；③BMI＞30的肥胖症患者；④有长期吸烟史，并且目前仍吸烟者；⑤孕妇及哺乳期妇女；⑥有精神性疾病、无自知力、不能确切表达及合作者；⑦未签署知情同意书者；⑧正参加其他临床实验的患者；⑨其他研究人员认为不适合参加临床实验的患者。

1.4 病例的随机化与分组

将患者编号，按照随机数字表，将患者植皮区按左右两边随机分为实验组和对照组。

1.5 脂肪抽吸手术及SVF分离提取

常规抽脂方法抽吸患者腹部脂肪约50～60 mL，吸出的脂肪静置分层，用0.9%氯化钠注射液清洗2～3次，去除下层液体。将抽取的脂肪液混合原酶，消化时浓度为0.02%，置离心管中，37℃消化1 h，然后置于离心机中，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入10 mL 0.9%氯化钠注射液重悬，40 μm滤网过滤，置于离心机中1 500 r/min离心5 min，洗涤2～3次，得到沉淀细胞集合即为SVF。

1.6 SVF移植

在植皮区打包前，以1mL针管将获得的SVF均匀注于实验组皮片与植皮受区之间隙处，同时辅以轻柔按摩促进SVF均匀分散作用于受区。1 cm2植皮区域注射SVF细胞数量约1×105cells/cm2，对照组植皮区注射等量0.9%氯化钠注射液，植皮区打包加压固定。

1.7 病例随访及检测

植皮术后1个月、3个月、6个月和12个月随访受试者。使用Cutometer dual MPA 580皮肤测试仪检测移植皮片和皮片供区周围正常皮肤的质地，皮肤测试仪含有不同测试探头，可分别测试弹性、含水量、色素、摩擦力、温度等指标。使用皮肤检测仪前，对应探头需连接Cutometer dual MPA 580主机，每次于同一皮片表面的不同部位测试3次，取平均值。所测试的部位分别为：实验组皮片；对照组皮片；取皮区正常皮肤。

每次随访时用透明薄膜覆盖植皮区，然后使用记号笔在透明薄膜上沿着植皮区边缘描画出双侧植皮区范围，沿边缘裁剪后置于深色背景下，用同一数码相机设置相同参数以相同高度进行拍摄，之后存入电脑，使用绘图分析软件AutoCAD进行分析比较，计算皮片的回缩率。

观察并记录是否出现皮片血供不佳、愈合不良或者感染等情况，评价SVF辅助植皮的安全性。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 病例入组情况

2014年4月至2015年12月，入组受试者共18人，男、女各9例，年龄3～60岁。均行全身多处对称部位植皮手术或者同一部位多处植皮手术。所有患者第1个月均回访，最早入组的受试者已完成12个月随访，最晚入组的受试者已完成3月随访，4名受试者完全失随访。

术前均按照实验设计随机将植皮受区分成实验组和对照组，术前常规拍照，并记录受试者完整信息。植皮手术由同一组医师完成，术中所需的脂肪组织获取和SVF提取由另一位医师单独完成，术后随访则由同一位医师完成（图1）。

图1 植皮手术及SVF移植Fig.1 Skin grafting and SVF transfer

2.2 皮肤测试仪测试移植皮片质地

皮肤测试仪测试植皮皮片和供皮区的色素、含水量、摩擦力、温度等指标。

随访发现，实验组移植皮片色素沉着减少，其颜色更接近于取皮区正常皮肤颜色，在植皮后期6个月和12个月随访时实验组较对照组有明显改善（P＜0.05）；含水量方面，移植皮片实验组从第3个月随访起，皮片含水量均高于对照组皮片，并且在植皮恢复期（3个月、6个月）时，实验组皮片含水量明显高于对照组（P＜0.05）。移植皮片的摩擦力即皮片的光滑程度，摩擦力越大，皮片越粗糙。在随访早期即观察到实验组皮片光滑程度有明显改善，从随访第3个月至第12个月时，实验组皮片摩擦力均明显低于对照组（P＜0.05）；移植皮片的温度在随访过程中保持稳定（图2）。

图2 植皮皮片的色素、含水量、摩擦力及温度Fig.2 The skin color，water content，friction and skin temperature of the grafted skin

2.3 皮肤测试仪测试移植皮片弹性

皮肤测试仪测试植皮皮片和供皮区皮肤的弹性，两组移植皮片之间进行对比。随访结果显示，实验组皮片弹性均优于对照组皮片，并且在皮片移植后第3个月起即有明显改善（P＜0.05），实验组皮片弹性更接近于取皮区正常皮肤的弹性（图3）。

图3 移植皮片弹性测试结果Fig.3 The elasticity of the grafted skin

2.4 移植皮片回缩率

皮片移植后回缩是皮片移植的难点，移植的皮片越薄，回缩越严重，特别是关节周围的皮片移植。

各个随访时间点，实验组回缩率均低于对照组，第1个月和第3个月时有统计学差异。植皮皮片在随访第1个月时回缩率，实验组为（2%±1.0%），对照组为（12%±1.6%），P＜0.05；第3个月时回缩率，实验组为（12.5%±3.35%），对照组为（25%±5.0%），P＜0.05（图4）。

图4 植皮皮片回缩率Fig.4 The contracture of the grafted skin

2.5 SVF辅助皮片移植的安全性

本组患者术后均未出现皮片血运障碍、愈合不良、皮片感染或者皮片坏死等情况。随访时，患者植皮皮片均存活良好，未有局部皮温异常，皮片及周围未见红肿感染等。抽脂部位部分患者可有局部青紫，1个月后消退，未有其他不适。SVF辅助皮片移植不影响皮片存活。

3 讨论

SVF来源于脂肪组织，内含有多种组织细胞，其中最重要的细胞成分为ASCs［10］，拥有可诱导分化成多种组织细胞的能力和增殖能力，ASCs强大的内分泌能力是其发挥作用的主要方式之一［11］。ASCs作为成体干细胞，其使用和伦理限制较胚胎干细胞少，但是分离提取比较复杂，需要体外培养［12］。实验室使用的培养液添加胎牛血清，有携带病原、污染细胞的风险，体外培养也可能因各种操作等原因导致细胞分化和变异，若再次返回人体进行干预处理，存在诸多安全隐患。这些都限制了ASCs在人体疾病治疗方面的应用。而SVF来源于脂肪组织，是一类多细胞的集合，无需体外培养，其分离提取的步骤简单，分离和处理可全程无菌操作，降低了分离提取污染的概率，同时分离时间较短，可直接在手术同时进行［13］，避免多次手术伴随的其他风险。SVF无需培养即可直接应用，避免了使用异种血清涉及的伦理问题。

SVF及ASCs已广泛应用于烧伤和整形外科领域的组织创伤修护和瘢痕修复中，如乳房软组织缺损［13］、面部瘢痕［14］、半面萎缩［15］、足部难治性溃疡［16］、皮肤创伤［17］等；其他方面，如多发性硬化症［18］、退行性关节炎［19］、骨软骨缺损［20］等也有大量研究应用。这些都证明了SVF和ASCs具有减少组织缺血缺氧、促进血管新生和促进组织再生的能力。我们前期的动物实验中发现，SVF能在早期促进皮片存活，增加皮片的血供［9］，并且在后期减少皮片的回缩，同时增加了皮片的柔软度。

本临床实验在植皮手术同时抽取受试者自体脂肪组织进行消化处理，术中即可获得SVF，方法简单，且不增加正常手术时间。少数患者抽脂部位局部出现青紫，这属于抽脂后正常现象，多数在1个月之内便可自行恢复。

本组患者术后未见皮片愈合不佳或感染坏死等，实验组和对照组均存活良好。

皮肤质地的测试是通过皮肤测试仪完成的，我们使用的皮肤检测仪是德国Courage+Khazaka公司生产的Cutometer dual MPA 580皮肤测试仪，配备了测试弹性、色素、水分、摩擦力和温度的探头。Cutometer dual MPA 580皮肤测试仪测试各项指标的原理都不同：弹性测试是通过一定的负压作用于皮肤，记录皮肤的变形能力和回复至正常位置的能力；色素是测试皮肤的黑色素和血红素的含量，皮肤的颜色主要是这两种色素决定的，测试是基于光的吸收原理，测试探头发出三种特定波长的光，接收器接受皮肤反射的光并处理得到的数据；皮肤水分的测试是基于电容法，这种方法是根据水的介电常数和其他物质的介电常数不同，测试电容器按照皮肤水分含量的不同显示出电容量的变化从而计算出水分含量；皮肤摩擦力测试是测试探头内部有个微型电动机和齿轮转动装置，当探头在不同的皮肤表面测试时，因皮肤表面的摩擦力不同，电机转动需要的扭矩则不同，皮肤越光滑电机转动需要的扭矩就越小，根据不同皮肤表面测得的扭矩计算出皮肤摩擦力；皮肤的温度测试则是利用特殊的传感器接收皮肤表面发出的红外线来测试皮肤表面的温度，是一种皮肤表面温度的非接触式测量方法。此皮肤测试仪测试原理科学、结果稳定可靠，已在多项临床实验中用于皮肤质地的测试和评价［21-22］。

我们利用皮肤检测仪检测了皮片弹性、色素沉着、皮片的含水量、皮片表面的摩擦力还有皮片温度，观察到实验组皮片质地较对照组有明显改善。

植皮后皮片回缩一直是植皮技术难以解决的问题，临床上观察到皮片厚度越薄，术后回缩越严重。目前认为，皮片早期回缩是与皮片中弹性纤维含量有关，全厚皮片所含的弹性纤维多，早期回缩率大于刃厚皮片；而晚期回缩主要是由于创面回缩引起的，此时，皮片越厚越硬，回缩越小。Kucukkaya等［23］在动物实验中发现，在皮片移植时，植皮部位注射肉毒毒素能减少创面周围及基底部回缩，并促进皮片下成熟的胶原组织形成，有效降低移植皮片的回缩率。这可能与肉毒素减少创面基底和周围肌肉回缩，减少了对皮片的回缩牵拉有关。另一影响因素则是皮片的早期血供情况［2］，皮片血供良好则存活良好、回缩较小，动物实验表明，利用ASCs辅助皮片移植能有效改善创面血供，促进创面愈合，减少创面回缩率［24］。

我们发现，各个随访时间点，实验组回缩率均低于对照组，第1个月和第3个月时有统计学差异。我们所有受试者在完成植皮手术拆线后，都定做了支架，在康复医师的指导下，每日坚持佩戴支架并进行牵拉锻炼。早期皮片回缩主要与弹性纤维回缩有关，这种回缩可通过持续支架牵拉和锻炼改善，而晚期皮片回缩主要是与皮片基底创面回缩有关。早期，SVF中的ASCs能分泌多种促血管生成因子，促进局部组织的抗缺血缺氧能力和生产血管的能力［25］，减轻了早期皮片因缺血缺氧导致的存活不佳，促进早期皮片的存活，减少皮片的回缩率。我们观察到SVF辅助皮片移植降低了皮片的回缩率，但在术后6个月和12个月时，虽然数值上实验组回缩率低于对照组，但是没有统计学差异，这可能与手术时辅助移植的SVF的量有关，若手术时增加SVF单位皮片面积的用量或者在6个月时再次获取SVF用于皮片区的治疗，可能能进一步降低皮片的远期回缩率。

4 结论

SVF辅助皮片移植能够有效改善植皮后的皮片质地，减少皮片回缩，并且方法简单，安全可行。

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Effect of Autologous Stromal Vascular Fraction （SVF）in Adipose Tissue on Skin Grafting

MAO Xiyuan，LI Hua，CHENG Chen，LI Qingfeng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 20011，China.Corresponding author：LI Qingfeng
（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）.

Objective To explore the improving effect of autologous stromal vascular fraction （SVF）in adipose tissue on skin grafting.Methods The adipose tissue was harvested at the same time of skin grafting，then digested and processed；SVF （1×105cells/cm2）was obtained and injected into the grafted skin as the treatment group，while saline was injected as self-control；The elasticity，color，texture and contracture of skin grafts were observed and measured 1 month，3 months，6 months and 12 months after operation.Results From April 2014 to December 2015，18 patients were enrolled.No necrosis of skin grafts was observed in both control group and treatment group（P＞0.05）.During the follow-ups，compare to the control group，the skin color of the treatment group was more similar to the normal skin 6 months and 12 months after operation （P＜0.05）；The skin water content of the treatment group was higher than that of the control group 3 months and 6 months after operation （P＜0.05）；Compare to the control group，the frictional force and the skin elasticity of the treatment group were both improved 3 months，6 months and 12 months after operation （P＜0.05）；The contracture rate of the treatment group was lower than that of the control group 1 month and 3 months after operation （P＜0.05）.Conclusion The transplantation of SVF is a safe and effective method for skin grafting by improving skin color，texture and reducing skin contracture.

Stromal vascular fraction；Skin grafting；Skin retraction

·论著·

R622

A

1673－0364（2016）04－0207－06

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.001

国家科技支撑计划（2012BAI11B03）。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

李青峰（E-mail：dr.liqingfeng@shsmu.edu.cn）。

（2016年3月24日；

2016年5月9日）