慢性肢体淋巴水肿皮肤微淋巴管病理性肌化

于子优 孙笛 罗毅 刘宁飞

慢性肢体淋巴水肿皮肤微淋巴管病理性肌化

于子优 孙笛 罗毅 刘宁飞

目的 探索淋巴水肿过程中皮肤微淋巴管的病理生理改变。方法 自2013年11月至2015年9月，对37例淋巴水肿患者（原发性淋巴水肿26例，继发性淋巴水肿11例）行皮肤活检术，切取足背或上臂内侧全层皮肤，以正常人皮肤标本作为对照组（n=7），免疫荧光染色标记淋巴管内皮标志物Podoplanin，平滑肌标志物α-SMA，计算每位患者α-SMA+淋巴管%（α-SMA+淋巴管数/淋巴管总数）、淋巴管密度、管腔面积，并与对照组比较。吲哚菁绿淋巴造影（ICG lymphography）检查淋巴管功能。结果 淋巴水肿患者皮肤微淋巴管出现不同程度的“肌化”改变。原发性、继发性淋巴水肿患者组α-SMA+淋巴管%分别为47.5%、73.2%（中位数），均显著高于对照组（3.5%），P＜0.01；两实验组管腔面积均大于对照组，P＜0.05；两实验组淋巴管密度与对照组差异无统计学意义。不同于健肢淋巴管的影像学表现，淋巴水肿肢体均呈现出真皮反流的荧光影像。结论 皮肤微淋巴管“肌化”为原发性和继发性慢性肢体淋巴水肿的重要病理改变，并参与疾病的演变。

淋巴水肿 毛细淋巴管 平滑肌细胞 肌化

淋巴水肿（Lymphedema，LE）是由淋巴循环障碍导致淋巴液在组织内滞留，而形成的慢性进行性组织高蛋白性水肿，多累及肢体，最终可导致肢体畸形与残疾［1］。根据病因，可将淋巴水肿分为淋巴管发育异常所致的原发性淋巴水肿和肿瘤根治手术、放疗、创伤等原因引发的继发性淋巴水肿。淋巴水肿已成为乳腺癌及妇科肿瘤术后最常见的并发症之一，严重影响患者的生活质量。以手法淋巴引流综合消肿治疗（Complex Decongestive Therapy，CDT）为主的保守治疗是目前最广泛采取的治疗方式，其他治疗还包括弹性材料、空气波压力治疗、淋巴管-静脉吻合手术等，以上治疗虽能有效减轻水肿，但淋巴水肿仍无法治愈，缺乏有效的根治手段。不论原发或继发性淋巴水肿，虽然已知的病理结局包括皮肤增厚、纤维化、脂肪沉积和慢性炎症等［2-3］，但对淋巴管的病理生理改变一直了解较少，这成为判断淋巴水肿愈后、选择正确治疗方法和疗效预估的瓶颈。

既往针对集合淋巴管的研究，揭示了其在淋巴水肿中的扩张、破裂、硬化，甚至闭塞等结构或功能改变［4-7］，但对与其紧密相连、分布甚广的皮肤淋巴管或微淋巴管的研究甚少，仅有的报道包括荧光微淋巴管造影 （Fluorescence Microlymphangiography，FM）和间接淋巴造影（Indirect Lymphography，IL），关注了病理状态下微淋巴管的变化。有报道指出，继发性淋巴水肿患者出现前集合淋巴管数量的增加［8］，而原发性淋巴水肿患者可表现为皮肤淋巴管的扩张、增生或不发育［9-13］。在Allegra等［14］对原发性LE的描述中，随水肿程度进展，毛细淋巴管口径增加，毛细淋巴管内压、组织间隙压力增加，显影速度和造影剂排空时间延长。

作为淋巴管道的起始及淋巴循环的起点，毛细淋巴管以其独特的精细结构行使吸收组织间液，形成和输送淋巴液的重要功能，淋巴循环得以启动。解剖学上，皮肤淋巴管由毛细淋巴管和前集合淋巴管组成。毛细淋巴管呈一盲端，由单层淋巴管内皮细胞构成薄壁管腔，管壁无平滑肌细胞，无连续的基膜，管腔内无瓣膜［15-17］。内皮细胞通过锚丝附着于细胞外基质，使组织内压变化始终与内皮细胞间的开闭相协调，当淋巴液积聚，组织内压力增大，锚丝张力增高，牵拉内皮细胞，大分子物质即通过宽松的细胞连接进入毛细淋巴管，组织内压下降，内皮间“瓣膜样”重叠结构又阻止了淋巴液返流。淋巴液继而被运输至前集合淋巴管，在皮肤中，前集合淋巴管通常分布在真皮深层靠近皮下组织处，其管壁可有不连续的平滑肌分布，管腔内也开始出现瓣膜结构［18］。通过毛细淋巴管和前集合淋巴管，组织内淋巴液得以生成并运输至集合淋巴管，那么在淋巴回流受阻的病理状况下，皮肤微淋巴管将发生何种改变，可能对淋巴水肿的治疗和预后产生何种影响呢？

本研究通过对37例淋巴水肿患者皮肤标本，进行免疫荧光标记淋巴管内皮细胞特异性抗体podoplanin和平滑肌特异性抗体α-SMA，结合临床资料及影像学表现，首次发现了皮肤微淋巴管在原发与继发性淋巴水肿中“肌化”的特异性病理改变，为研究慢性淋巴水肿的病理生理机制及靶向治疗提供了新思路。

1 资料和方法

1.1 临床资料与标本收集

从2013年11月至2015年9月，共纳入37例肢体慢性淋巴水肿患者，男16例，女21例，年龄5～69岁，平均（34±19.0）岁。其中原发性淋巴水肿26例，继发性淋巴水肿11例（乳腺癌术后2例，妇科肿瘤术后9例），累及上肢7例，下肢30例，平均病程（12.5±11.0）年。按ISL诊断分类［19］：Ⅰ°肢体淋巴水肿1例，Ⅱ°16例，Ⅲ°14例，Ⅵ°6例。所有病例均行皮肤活检术，切取水肿肢体足背或上臂腹侧全层皮肤。对照组（n=7）皮肤标本来自正常志愿者。患者临床诊断及标本收集均在我院淋巴治疗中心进行，所有受试者均签署知情同意书，该临床试验已通过上海市第九人民医院伦理委员会批准。

1.2 实验试剂及仪器

小鼠抗人podoplanin（Angiobio公司，美国），兔抗人alpha smooth muscle actin（Abcam公司，英国），Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗体（Invitrogen公司，美国），Alexa fluor 488山羊抗兔抗体（Invitrogen公司，美国）；PDE荧光定位仪（Hamamatsu公司，日本）；共聚焦显微镜（Carl Zeiss公司，德国）；Image Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）。

1.3 影像学检查

随着近年来吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG）及红外荧光成像技术在淋巴管造影方面的应用，使皮肤浅表淋巴管显影和观察病理状态下淋巴回流的动态变化成为可能。我们对6例原发性LE（Ⅰ°2例，Ⅱ°3例，Ⅵ°1例）和5例继发性LE患者（Ⅲ°）行ICG荧光淋巴造影 （Indocyanine Green Lymphography），以患者健肢为自身对照，以2.5 mg/mL ICG 0.05 mL注射于双足背或双手背指蹼间，采用PDE荧光定位仪（Photodynamic Eye）在造影剂注入的同时开始观察荧光成像，注射后30 min再次观察。

1.4 免疫荧光染色

TL：Chinese Proverb-an outwardly attractive but worthless person

标本4%多聚甲醛固定、包埋，5 μm切片，二甲苯、梯度乙醇脱蜡、水化，置于98℃、pH=6的柠檬酸修复液中抗原修复30 min，滴加0.2%Triton X-100室温5 min，5%BSA封闭30 min。滴加小鼠抗人podoplanin（1∶50）、兔抗人alpha smooth muscle actin （1∶300），4℃过夜，PBS浸洗 （5×5 min），滴加二抗Alexa fluor 555山羊抗小鼠抗体（1∶300）、Alexa fluor 488山羊抗兔抗体（1∶300），37℃，1 h。DAB显色8～10 min后封片。

1.5 皮肤淋巴管计数分析

标本荧光染色后，在共聚焦显微镜下拍摄重建组织的拼图，观察并计数皮肤淋巴管α-SMA+平滑肌细胞的募集情况。每个标本中α-SMA+淋巴管的百分比 （α-SMA+Lv%）计算公式：（α-SMA+淋巴管数/淋巴管总数）×100%。淋巴管管腔面积（中位数）由Image Pro Plus 6.0软件测量。淋巴管密度由淋巴管总数/切片总组织面积算得。

1.6 统计学分析

使用SAS v9.2软件进行统计学分析。所有结果采用中位数（极值）或计数（%）表示。组间比较采用Wilcoxon秩和检验，当P＜0.05时，为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤微淋巴管病理改变

2.1.1 大体改变

与对照组相比，LE患者皮肤均明显增厚、纤维化，可见大量炎细胞浸润，除1例原发性LE病人皮肤淋巴管表现为小而塌陷的形态结构外，绝大多数淋巴管管腔明显扩张。原发与继发组管腔面积分别为304 μm2和856.7 μm2（中位数），与对照组比较差异显著（P＜0.05），表明两LE组淋巴管管腔均明显扩张。两LE组皮肤淋巴管密度与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2.1.2 淋巴水肿病人皮肤淋巴管“肌化”

通过免疫荧光染色观察α-SMA+平滑肌细胞在病人淋巴管管周的募集，计算得到平均α-SMA+Lv%在原发与继发组分别为47.5%和73.2%，均显著高于对照组（P＜0.01）。平滑肌募集可同时见于扩张或“塌陷状”的淋巴管，表现为一个或几个细胞不连续环绕在淋巴管内皮细胞周围，亦可表现为成束平滑肌分布在淋巴管周围（图1b、c）。淋巴水肿患者皮肤中，不同性别或不同水肿部位间α-SMA+Lv%差异无统计学意义，α-SMA+Lv%与病程、水肿分期、皮肤淋巴管密度均未见相关性。

2.2 影像学表现

健肢荧光影像通常表现为自足背或手背注射点发出数条清晰的线性淋巴管影并逐渐上行 （图1d、g）。通常在皮内注射过程中即可见自注射点开始显影的淋巴管，说明毛细淋巴管吸收造影剂在数秒内即可完成。

淋巴水肿肢体表现出不同形式的皮下弥散和真皮反流。在原发性淋巴水肿患者中，注射造影剂后淋巴管常难以显影，30 min后足背出现局限性造影剂弥散和真皮反流（图1e、h）。在继发性淋巴水肿患者中，虽注射后可见延迟的淋巴管显影，30 min后常出现大片皮下弥散和真皮反流的荧光影像（图1 f、i）。

表1 淋巴水肿病人与对照组的组间比较Table1 Comparisons between lymphedema patients and controls

图1 正常、原发、继发性淋巴水肿皮肤组织podoplainin、α-SMA免疫荧光染色和ICG淋巴造影影像学观察Fig.1 ICG lymphographic findings and immunofluorescent staining of podoplainin，α-SMA in control and lymphedematous skin

3 讨论

对慢性肢体淋巴水肿组织中淋巴管形态和功能的研究，主要聚焦于大的集合淋巴管，而对皮肤淋巴管改变的研究甚少。虽有文献提及了LE患者皮肤淋巴管口径的增加和密度的变化［9］，且通过荧光微淋巴管造影可观察到毛细淋巴管充盈范围及运输功能的变化［9，13-14］，但对其结构改变及病理机制的研究仍鲜有报道，对淋巴水肿疾病过程发生发展规律认识的不足，亦使临床治疗面临困境。

本研究中，我们探索了慢性肢体淋巴水肿过程中皮肤淋巴管的病理生理改变，发现了皮肤微淋巴管“肌化”的独特病理现象。在原发与继发性LE病人中，分别存在47.5%和73.2%的皮肤淋巴管被不均匀分布的平滑肌细胞环绕，管壁的增厚、管腔通透性的降低提示这些“肌化”的淋巴管功能已受损。在ICG荧光淋巴造影过程中，LE肢体淋巴管显影时间，即毛细淋巴管吸收造影剂时间往往较健肢明显延长［14］。α-SMA+Lv%与病程及水肿分期无明显相关性，但值得注意的是，1例病程仅为3个月的Ⅰ°双下肢原发性LE病人，α-SMA+Lv%已达76%，表明“肌化”可发生在淋巴水肿早期或潜伏期阶段，临床表现尚不明显时，淋巴管的组织学病变可能已非常显著，且在ICG荧光淋巴造影检查中可观察到在Ⅰ°LE患者中，即见淋巴管显影的延迟及弥散的荧光影像。以上结果表明，微淋巴管“肌化”的病理改变可能贯穿着整个疾病发展过程，并在早期影响淋巴管功能。

类似“肌化”或硬化的病理改变在对集合淋巴管的研究中也有报道［4-5］。正常集合淋巴管管壁存在平滑肌层，在两相邻瓣膜间，平滑肌的收缩与瓣膜的开闭形成有功能的收缩单位，保证了淋巴液的单向运输［15-16，20］。大量体内外实验表明，在集合淋巴管跨壁压增加时，淋巴管平滑肌的收缩频率和收缩力均明显增加［21-22］。Ogata等［4］报道了继发性淋巴水肿病人集合淋巴管“硬化”现象，即管壁平滑肌增生伴表型改变，且管壁病变程度与水肿严重程度成正比。可能是在水肿发生发展过程中，集合淋巴管作为具有主动收缩功能的肌性管道，在长期管内高压的负荷下，出现代偿性管壁平滑肌增生与重塑，晚期影响功能。若集合淋巴管“硬化”导致了其收缩功能的下降，那么毛细淋巴管“肌化”可能影响着淋巴液的生成与运输。两者是否存在相同的病理机制还有待研究，但管腔内压增高势必同样累及微淋巴管，长期淋巴液瘀滞、管壁牵张、管内外高压可能是“肌化”发生的主要原因之一。单层淋巴管内皮细胞构成的微淋巴管被平滑肌细胞覆盖后，“肌化”对附着在其表面的锚丝的结构和功能有何影响目前尚不可知。有理由推测，平滑肌的附着可能增加微淋巴管管壁的厚度，影响锚丝牵拉对内皮细胞之间连接处的开放和闭合功能，从而降低有效淋巴液的生成。我们的研究显示，平滑肌包绕的微淋巴管的管壁明显增厚，呈现持续的扩张状态，在淋巴回流阻力增加、管腔压力持续存在的情况下，淋巴液在“肌化”或“硬化”的微淋巴管和组织之间形成所谓的双向流动，这可能就是真皮反流的病理基础。体内及体外实验探索生理及病理状态下淋巴管内皮细胞-平滑肌细胞间的信号通路可能为深入理解其分子机制提供线索。

至今，淋巴水肿仍尚无根治方法，CDT虽可有效减轻水肿，但仍需终身治疗。以淋巴管-静脉吻合手术为主的手术治疗往往远期效果不佳。淋巴水肿所伴随的一系列病变包括脂肪沉积、组织纤维化以及集合淋巴管管壁的增厚、纤维化、甚至闭塞等，一旦发生便不可逆。皮肤淋巴管的“肌化”可能是淋巴水肿过程中诸多病理改变的一个环节，虽然目前尚不知“肌化”微淋巴管的发生发展过程以及“肌化”对淋巴水肿转机的影响，但由于皮肤微淋巴管在淋巴液形成中所起的重要作用，“肌化”的结果势必导致淋巴液生成障碍和在组织中的滞留，功能性皮肤微淋巴管数量的下降可能参与解释了当前淋巴水肿治疗困难和病程不可逆性的原因，如不使其恢复正常的生理结构，治愈则无从谈起。“去肌化”可能成为慢性肢体淋巴水肿的新治疗靶点之一。

4 结论

皮肤微淋巴管“肌化”为原发性和继发性慢性肢体淋巴水肿的重要病理改变，可发生在淋巴水肿的极早期阶段，主要通过影响微淋巴管的吸收功能而加重淋巴循环障碍。对“肌化”发生的分子机制的研究将为其靶向治疗提供可能。

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Myogenesis of Lymphatic Capillaries in Chronic Lymphoedematous Skin

YU Ziyou，SUN Di，LUO Yi，LIU Ningfei.Department of Plastic and Reconstructive Surgery，Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200011，China.Corresponding author：LIU Ningfei
（E-mail：liuningfei@126.com）.

Objective To explore the pathophysiological changes of skin lymphatic capillaries in patients with chronic lymphedema （LE）.Methods From November 2013 to September 2015，37 patients （26 with primary LE and 11 with secondary LE）and 7 healthy controls were enrolled in the study.Full-thickness skin on the lymphedematous limb was excised.Skin sections were immunofluorescently stained with podoplanin and α-smooth muscle actin （α-SMA）.The percent of α-SMA+lymphatic vessel were calculated.Meanwhile，the density and luminal area of dermal lymphatic vessel were measured.Lymphatic vessel function was assessed by Indocyanine green lymphography.Results Myogenesis of lymphatic capillaries were observed in primary and secondary lymphedematous skin.The α-SMA+Lv%in primary and secondary LE were 47.5%and 73.2%（median）respectively，which were both significantly higher than that of the control group（3.05%，P＜0.01）.The inner luminal area of lymphatic vessels in lymphedematous skin of experimental groups were greater compared with control group （P＜0.05）.The differences in the lymphatic vessel density between the two experimental groups and the control group were not statistically significant.In contrast with the imaging findings in healthy limbs，the lymphoedematous extremities all exhibited dermal backflow patterns.Conclusion Dermal lymphatic capillary myogenesis is an important pathological during the process of chronic lymphedema which might be involved in the evolution of the disease.

Lymphedema；Lymphatic capillaries；Smooth muscle cell；Myogenesis

R551.2

A

1673－0364（2016）04－0243－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2016.04.009

国家自然科学基金（81272146）。

200011 上海市 上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

刘宁飞（E-mail：liuningfei@126.com）。

（2016年4月6日；

2016年5月23日）