顺铂联合5-氟尿嘧啶对子宫内膜癌Ishikawa细胞的影响及其可能机制

王莉芹，瞿全新

(1.天津医科大学 研究生院，天津 300070；2.天津医科大学总医院滨海医院 妇产科，天津 300480；3.天津第一中心医院 妇产科，天津 300192)

顺铂联合5-氟尿嘧啶对子宫内膜癌Ishikawa细胞的影响及其可能机制

王莉芹1，2Δ，瞿全新3

(1.天津医科大学 研究生院，天津 300070；2.天津医科大学总医院滨海医院 妇产科，天津 300480；3.天津第一中心医院 妇产科，天津 300192)

目的 探讨顺铂联合5-氟尿嘧啶对子宫内膜癌Ishikawa细胞内分泌治疗的影响。方法 将人子宫内膜癌Ishikawa细胞系进行常规传代培养，选择处于对数生长周期的细胞分为3组：5-氟尿嘧啶(5 mg/L)组、顺铂(5 mg/L)组、顺铂(5 mg/L)+5-氟尿嘧啶(5 mg/L)组(联合组)，在给予相应的药物处理后进行MTT法检测细胞抑制率和流式细胞仪检测细胞凋亡情况，同时采用免疫印迹法检测Bcl-2和p65蛋白的表达情况。结果 联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞抑制率分别为(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，联合组的抑制率明显高于其他2组(P<0.05)。联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞凋亡率分别为(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，联合组的凋亡率明显高于其他2组(P<0.05)。联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的Bcl-2相对表达量分别为(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，p65相对表达量为(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，联合组的Bcl-2和p65相对表达量都明显少于其他2组(P<0.05)。结论 顺铂+5-氟尿嘧啶在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的联合使用能促使细胞凋亡，抑制细胞增殖，其机制可能与抑制Bcl-2和p65蛋白的表达相关。

顺铂；5-氟尿嘧啶；子宫内膜癌；Ishikawa细胞；细胞凋亡

子宫内膜癌(endometrial cancer)是一种高度恶性的肿瘤，是指原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤。同时多数子宫内膜癌生长缓慢，但部分特殊病理类型的子宫内膜癌发展很快，短期内出现转移[1-3]。由于早期症状不典型，确诊时多数患者的肿瘤已发展至晚期，失去手术机会，多数需要进行化疗[4]。顺铂(cisplatin )为铂的金属络合物，能干扰DNA复制，是治疗晚期肿瘤的一线药物；顺铂用于DNA 链间及链内交链，属周期非特异性药，作用类似烷化剂，能干扰DNA复制[5-6]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的同类物，在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶脱氧核苷酸后，以抗代谢物而起作用，可干扰DNA的合成[7-8]。为此本研究通过体外培养人子宫内膜癌Ishikawa细胞，采用逆转录聚合酶，通过细胞增殖等实验反映顺铂+5-氟尿嘧啶的抑癌作用，并探讨顺铂+5-氟尿嘧啶在子宫内膜癌的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞及试剂：人子宫内膜癌Ishikawa细胞系本实验室保存，常规冻存。10%国产胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、注射用顺铂(DDP，齐鲁制药公司)、注射用5-氟尿嘧啶(5-FU，紫竹制药公司)、二甲基亚砜(DMSO)、DEPC焦碳酸二乙酯(美国Amresco公司)、AnnexinV-FITC试剂盒(武汉晶美生物工程有限公司)；MTT试剂；蛋白裂解液；BCA蛋白定量检测试剂盒。

细胞培养条件：Ishikawa细胞用含100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养。

溶液配制：顺铂溶液的配制：顺铂用含3%新生胎牛血清RPMI 1640培养基溶解为1 mg/mL，避光4 ℃保存。5-氟尿嘧啶溶液的配制：配置方法同顺铂。

1.2 方法 研究时间为2014年2月～2015年2月。

1.2.1 细胞分组：将处于对数生长期的人子宫内膜癌Ishikawa细胞系的细胞浓度调至2×105/mL，培养于96孔板内(每孔加入量为100 μL)，在37 ℃、5%的CO2的孵箱中培养。实验分为3组：5-氟尿嘧啶(5 mg/L)组、顺铂(5 mg/L)组、顺铂(5 mg/L)+5-氟尿嘧啶(5 mg/L)组(联合组)，每组设置12个副孔进行相关指标的检测，处理细胞不同时间后，贴壁培养的细胞倒净培养液，用DEPC 处理过的PBS 洗涤一遍，进行后续处理。

1.2.2 检测方法

① MTT实验：采用MTT法可检测子宫内膜癌细胞增殖情况，将细胞按照1.2.1分组后给予对应药物处理，同时设置空白对照组(不给予任何干预措施)，24 h后加入MTT试剂，4 h后离心(12 000 r/min离心10 min)弃上清，细胞选择150 μL的DMSO溶解，492 nm滤光片采用酶标仪检测吸光度，自动计算得出细胞抑制率。

② 细胞凋亡实验：采用免疫荧光法流式细胞术检测细胞凋亡情况，将细胞按照1.2.1分组后以对应药物处理24 h后，采用4 ℃预冷的PBS缓冲液洗涤2次后离心，将250 μL的2×PBS与250 μL的灭菌去离子水混匀后悬浮细胞，每孔再加入5 μL的Annexin V-FITC和3 μL的碘化丙啶，充分混匀后室温下避光反应5 min，置于流式细胞仪检测相应凋亡情况。

③ 免疫印迹法检测Bcl-2和p65的表达：将细胞按照1.2.1分组后以对应药物处理24 h后收集细胞，置于Eppendorf管中，12 000 r/min离心1 min后去上清，收集沉淀物进行蛋白提取，严格按照裂解液说明书步骤进行细胞核和总蛋白的提取。采用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，按1:4的比例加入5×上样缓冲液，100 ℃沸水中煮10 min，聚丙烯酰胺凝胶上电泳后转膜，5%的脱脂奶粉封闭1 h，β-actin、Bcl-2、p65的一抗稀释液孵育4 ℃摇床过夜，TBST充分洗膜后加入二抗室温下孵育1 h，TBST洗膜后，滴加ECL显影液进行成像，Image J软件进行灰度分析。β-actin作为Bcl-2、p65的内参进行分析。

2 结果

2.1 细胞抑制情况对比 经过检测，联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞抑制率分别为(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，3组细胞抑制率比较差异有统计学意义(P<0.05)，联合组的抑制率明显高于其他2组(P<0.05)。见表1。

表1 不同组别的人子宫内膜癌Ishikawa细胞系抑制率情况对比Tab.1 Comparison of inhibition ratio of endocrine Ishikawa cells among

*P<0.05，与顺铂组相比，compared with DDP group；#P<0.05，与5-氟尿嘧啶组相比，compared with 5-FU group

2.2 细胞凋亡情况对比 经过检测，联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞凋亡率分别为(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，3组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.05)，联合组的凋亡率明显高于其他2组(P<0.05)。见表2。

表2 不同组别的人子宫内膜癌Ishikawa细胞系凋亡情况对比Tab.2 Comparison of apoptosis of endocrine Ishikawa cells among each group (±s，%)

*P<0.05，与顺铂组相比，compared with DDP group；#P<0.05，与5-氟尿嘧啶组相比，compared with 5-FU group

2.3 Bcl-2和p65的表达情况对比 经过检测，联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的Bcl-2相对表达量分别为(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，3组Bcl-2相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)，p65相对表达量为(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，3组p65相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)，联合组的Bcl-2和p65相对表达量都明显少于其他2组(P<0.05)。见表3。

表3 不同组别的人子宫内膜癌Ishikawa细胞系Bcl-2和p65的表达情况对比Tab.3 Comparison of Bcl-2 and p65 expressions in endocrine Ishikawa cells among each group (±s，%)

*P<0.05，与顺铂组相比，compared with DDP group；#P<0.05，与5-氟尿嘧啶组相比，compared with 5-FU group

3 讨论

子宫内膜癌是指原发于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，是最常见的妇科恶性肿瘤之一[9-10]。远处转移是子宫内膜癌生物学行为重要的方面，也是导致治疗失败的最主要原因[11]。同时晚期子宫内膜癌基本失去了手术治疗机会，化疗为治疗的重要手段，但既往研究发现子宫内膜癌在接受单药化疗治疗时会产生较强的化疗抵抗性，大大降低了治疗的效果，为此选择合理的化疗方案意义重大[12-14]。

5-氟尿嘧啶(5-Fu)为常见的抗代谢类抗肿瘤药，可在体内先转变为5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷酸，可抑制DNA的生物合成；也可阻止尿嘧啶和乳清酸掺入RNA，达到抑制RNA合成的作用。顺铂是治疗多种实体瘤的一线用药，为铂的金属络合物，主要作用于DNA链间及链内交链，干扰DNA复制[15-16]。本研究显示联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞抑制率分别为(41.45±3.13)%、(25.20±3.09)%和(23.19±4.10)%，联合组的抑制率明显高于其他2组(P<0.05)，表明药物联合使用可发挥协同作用，抑制肿瘤细胞的生长。

近年来随着子宫内膜癌发病的增多和年轻化趋势，积极的化疗能有效控制复发，从而提高患者的生存率和生活质量[17]。顺铂与5-氟尿嘧啶呈明显的剂量疗效依赖特点，但是剂量过大会导致毒副反应增加，限制了患者总的存率的明显提高[18]。有研究发现在低浓度顺铂作用下，DNA的驻留长度可从大约52 nm急剧减小为大约15 nm。而在高浓度DDP情况下，发现了DNA的成环和凝聚现象[19]。本研究显示联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的细胞凋亡率分别为(29.44±4.35)%、(5.74±1.12)%和(5.82±1.78)%，联合组的凋亡率明显高于其他2组(P<0.05)，也表明药物联合使用有化疗的增敏作用，对于各种化疗药物的细胞毒作用产生抵抗。

随着肿瘤分子生物学的进展，已经发现了多种信号分子在肿瘤生长、转移、侵袭、血管生成过程中发挥重要调控作用。比如p65转入核内时可促进下游抗凋亡蛋白的表达，抑制肿瘤细胞凋亡的发生，从而降低肿瘤细胞的放疗敏感性[20]。Bcl-2则通过阻止细胞质细胞色素C对caspase蛋白酶的激活，以及促进谷胱甘肽进入细胞核，抑制核内的氧化应激反应，从而发挥抗凋亡作用，下调Bcl-2和p65蛋白的表达有利于增加肿瘤细胞对放疗的敏感性，诱导肿瘤细胞的凋亡[8]。本研究显示联合组、顺铂组与5-氟尿嘧啶组的Bcl-2相对表达量分别为(0.31±0.11)、(1.23±0.49)和(1.28±0.59)，p65相对表达量为(0.67±0.23)、(1.67±0.56)和(1.71±0.71)，联合组的Bcl-2和p65相对表达量都明显少于其他2组(P<0.05)，表明药物联合使用可以有效抑制p65的核内转移从而下调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达，显著增加子宫内膜癌细胞的凋亡率。

总之，顺铂+5-氟尿嘧啶在子宫内膜癌Ishikawa细胞中的联合使用能促使细胞的凋亡，抑制细胞的增殖，其机制可能与抑制Bcl-2和p65蛋白的表达相关。

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(编校：王俨俨)

Effect of cisplatin combined with 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in endometrial cancer and its possible mechanism

WANG Li-qin1,2Δ, QU Quan-xin3

(1.School of Graduate, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Binhai Hospital of Tianjin Medical University General Hospital, Tianjin 300480, China; 3.Department of Obstetrics and Gynecology, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China)

ObjectiveTo investigate the effect of cisplatin and 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in the treatment of endometrial cancer.MethodsThe human endometrial cancer cell line Ishikawa were selected, at the logarithmic growth period, the cells were divided into three groups of 5-fluorouracil (5 mg/L) group, cisplatin (5 mg/L) group and cisplatin (5 mg/L) combined with fluorouracil (5 mg/L) group (combined group).After treated with corresponding drugs treatment, the cell viability was detected by MTT, the apoptosis was detected by flow cytometry, and the Bcl-2 and p65 expressions cells were detected by Western blot.ResultsThe inhibitory rate of combined group, cisplatin group and 5-fluorouracil group were (41.45±3.13)%, (25.20±3.09)% and (23.19±4.10)% respectively, and the inhibitory rate in the combined group was significantly higher than that of the other two groups (P<0.05).The apoptosis rate of the combined group, cisplatin group and 5- group were (29.44±4.35)%, (5.74±1.12)% and (5.82±1.78)% respectively, and the apoptosis rate in the combined group was significantly higher than that of the other two groups (P<0.05).The Bcl-2 relative expression in the combined group, cisplatin group and 5-fluorouracil group were (0.31±0.11), (1.23±0.49) and (1.28±0.59), the p65 expression were (0.67±0.23), (1.67 ±0.56) and (1.71±0.71), combined group of Bcl-2 and p65 relative expressions were obviously less than that of the other two groups (P<0.05).ConclusionCisplatin combined with 5- fluorouracil on endocrine Ishikawa cells in the treatment of endometrial cancer could promote cell apoptosis, inhibit the cell proliferation, and its mechanism may be related to the inhibition of Bcl-2 and p65 protein expressions.

cisplatin; 5- fluorouracil; endometrial carcinoma; Ishikawa cells; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.08.010

王莉芹，通信作者，女，本科，主任医师，研究方向：妇科肿瘤,E-mail：sdlclsxia@126.com。

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