小球藻Chlorella sorokiniana C74营养素分析

张玲，刘平怀，罗宁，陈晨，何沂飞，李昂（海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/教育部热带多糖资源利用工程研究中心，海南海口570228）

小球藻Chlorella sorokiniana C74营养素分析

张玲，刘平怀*，罗宁，陈晨，何沂飞，李昂
（海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室/教育部热带多糖资源利用工程研究中心，海南海口570228）

测定小球藻Chlorellasorokiniana C74营养成分，为其综合利用提供依据。结果显示，Chlorella sorokiniana C74含有丰富的营养物质，粗蛋白、多糖、油脂、灰分、粗纤维和色素分别占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。脂肪酸分析显示Chlorella sorokiniana C74中含有多种不饱和脂肪酸，其中亚油酸和亚麻酸含量分别为22.73% 和14.87%；氨基酸含量为17.50%，其中必需氨基酸为6.17%，通过必需氨基酸指数评价，说明Chlorella sorokiniana C74是一种优质的蛋白来源；维生素含量丰富，尤其是维生素B1、B3和B6；藻粉含有多种矿物质元素，其中钾、镁、钙、铁和锌5种元素含量较高，重金属铅、汞、砷和镉含量均未超标。

小球藻；营养成分；分析

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）为小球藻属（Chlorella）的一种微藻，细胞呈球形，卵形或者椭圆形，是一种生长在池塘、湖泊的浅水港湾中微型（3 μm～8 μm）单细胞绿藻。近年来，国内外对小球藻（Chlorella sorokiniana）的研究集中在培养条件优化［1-2］、产油性能评价及污水废气处理等方面［3-5］，对其胞内营养物质研究较少。有研究显示，不同营养元素条件下，小球藻的营养成分有显著差异［6］。本研究对规模化培养的小球藻C74进行一般营养成分、维生素、微量元素、氨基酸和脂肪酸等营养构成分析，为此株小球藻的开发利用提供科学依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1藻种

小球藻（Chlorella sorokiniana C74）：由海南大学生物工程综合实验室提供。

1.1.2试剂

维生素A（分析纯）：阿拉丁；维生素E（GR）：上海安谱科学；维生素B1、B2、B3、B6（分析纯）：都莱生物；维生素B12（GR）：阿拉丁；抗坏血酸（分析纯）、5-磺基水杨酸（分析纯）：广州化学试剂厂。

1.1.3仪器

CR22GⅡ高速冷冻离心机：日立；LGJ-25C冷冻干燥机：北京四环仪器；TU-1810紫外可见分光光度计：普析通用；AA-6800原子吸收分光光度计：岛津；X Series-电感耦合等离子体质谱仪：美国赛默飞世尔（Thermo Fisher）公司；TAS-990 Super AFG原子吸收光谱仪：普析通用。

1.2试验设计

1.2.1开放式培养

向微藻培养管道加入适量的自来水（约700 L），加入微藻培养所需营养元素，主要添加有尿素、甘氨酸、磷酸二氢铵、氯化铁等，另适当添加微量元素，打开管道循环泵（可调速），约30 min后接入种子液（50 L～80 L）。控制温度不超过40℃。培养周期约7 d。培养结束后，6 000 r/min离心6 min，藻泥经去离子水洗涤3次，真空冷冻干燥后保存于-20℃冰箱，备用。营养成分见表1。

表1 营养成分组成Table 1　The composition of nutrition

1.2.2常规成分测定

蛋白质：双缩脲法；总糖：蒽酮硫酸法；油脂：参照Luyen HQ［7］的方法测定；灰分：GB 5009.4-2010《食品安全国家标准食品中灰分的测定》灼烧重量法；粗纤维：GB/T 5009.10-2003《植物类食品粗纤维测定法》；色素参照Wellburn AR［8］的方法进行测定。

1.2.3脂肪酸分析

取藻粉0.5 g，加入0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液5 mL，震荡混合10 min，60℃水浴10 min，待溶液冷却后加入1%硫酸-甲醇溶液8mL，震荡混合10min，50℃水浴10 min，依次加入2 mL水和3 mL正己烷，分层后收集上层溶液（正己烷），重复萃取1次，合并正己烷溶液，待挥发浓缩至1 mL后，0.22 μm微孔滤膜过滤，密封保存待检测，通过气质联用仪进行检测。

1.2.4氨基酸分析

1.2.4.1水解及检测

称取适量样品于研钵中研磨破碎细胞壁，加入10%磺基水杨酸20 mL，混合均匀，于4℃下放置15 h～17 h，5 000 r/min离心6 min，滤液用4 mol/L NaOH调整pH至6.0，加入超纯水定容至50 mL，取1 mL滤液用0.22 μm滤膜过滤，取混合氨基酸标准溶液及待测滤液10 μL，进行柱前衍生处理后采用Waters 2695液相色谱仪进行检测。

色氨酸参照GB/T 15400-1994《饲料中色氨酸测定方法分光光度法》来测定。

1.2.4.2必需氨基酸指数（EAAI）

根据蛋白质饲料的评价方法——必需氨基酸指数（EAAI），评价氨基酸作为蛋白质的可用性。EAAI计算公式［9］如下：

式中：aai为待测样品中某必需氨基酸占必需氨基酸总量的百分数，%；AAi为参比蛋白质中该必需氨基酸占必需氨基酸总量的百分数，%；n为必需氨基酸数。

1.2.5维生素含量测定

1.2.5.1样品处理

水溶性维生素（维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B12）：准确称取一定量的小球藻藻粉于研钵中研磨破碎细胞壁，用15 mL 0.1 mol/L的盐酸浸泡，用超声清洗器振荡15 min，5 000 r/min下离心6min，上清液过滤，取滤液100 μL进样分析。

脂溶性维生素（维生素A、维生素E）：参照GB/T 5009.82-2003《食品中维生素A和维生素E的测定》处理样品。

1.2.5.2检测方法

1）维生素B1

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相：0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）= 97∶3；检测波长为254 nm；流速1.5 mL/min。

2）维生素B2

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相：A为0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=9∶1，B为甲醇，A∶B=75∶25；检测波长270 nm；流速1.0 mL/min。

3）维生素B3

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相0.05 mol/L KH2PO4-甲醇=9∶1；检测波长266nm；流速1.0 mL/min。

4）维生素B6

Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相：A为0.05 mol/L KH2PO4-乙腈（0.2%三乙胺，pH=6）=97∶3，B为甲醇，A∶B=9∶1；检测波长为226nm；流速1.2 mL/min。

5）维生素B12

Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；其他色谱条件参照GB/T 5009.217-2008。

6）维生素A、维生素E

色谱柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相：甲醇∶乙腈=1∶1；检测波长325 nm（维生素A），295 nm（维生素E）；流速1.0 mL/min。

7）维生素C

参照GB/T 5009.86-2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定荧光法和2，4-二硝基苯肼法》测定。1.2.6微量元素及重金属测定

准确称取0.2g藻粉于聚四氟乙烯坩埚中，加入5mL HNO3和2 mL H2O2为消解酸体系，加盖后于电热板上100℃加热。2 h后，开盖，将温度升高至160℃继续加热，应经常摇动坩埚。当坩埚内溶液呈澄清状时，消解完成，取下待其冷却，用超纯水轻轻冲洗坩埚盖和内壁，定容至25 mL。

采用电感藕合等离子发射光谱-质谱（ICP-MS）方法，对小球藻中Mg、Ca、Fe、Cu、Zn、Se、Ga等28种微量元素进行定量分析，采用原子吸收光谱仪对Na、K两种常量元素进行含量测定。

2　结果与分析

2.1常规成分

蛋白质、多糖、油脂是生命的三大物质基础，是维持生命必不可少的营养成分，膳食纤维是健康饮食不可缺少的，纤维在保持消化系统健康上扮演着重要的角色，同时摄取足够的纤维也可以预防心血管疾病、癌症、糖尿病以及其它疾病。

按照《中华人名共和国国家标准》及相关文献测定小球藻藻体内的粗蛋白、碳水化合物、油脂、色素、灰分、粗纤维等成分。测定结果见表2。

表2数据表明，小球藻中多糖含量最高（34.28%），其次为油脂，约占22%，有研究报道小球藻的油脂含量可达50%，说明小球藻具有作为产油微藻的潜能［3］。粗蛋白和粗纤维的含量相近，约为20%，蛋白含量在小球藻中相对较低，这可能与培养条件相关；灰分含量约占藻体干重的12%，微藻中的灰分含量及组成与自然条件和成熟度等因素有关［10］。小球藻中色素含量约为4.5%左右，叶绿素和类胡萝卜素是细胞中的重要色素，其中叶绿素a是人类和动物血红素的直接原料，被称作是“绿色的血液”，类胡萝卜素是一种高度不饱和化合物，具有抗氧化与增强免疫等功效。

2.2脂肪酸分析

脂质的主要功能是组成生物膜、提供能量、作为脂溶性物质的媒介。流行病学证明多食不饱和脂肪酸有利于身体健康，具有降血压、降血脂以及抗动脉粥样硬化、增强记忆力和思维能力等生理活性［11］。本研究采用气相色谱和气质联用仪对小球藻脂肪酸成分进行定量和定性分析，结果见表3。

表2 小球藻主要营养成分的含量Table 2　Contents of main nutritional component in Chlorella sorokiniana C74

表3　小球藻脂肪酸的组成Table 3　Fatty acids composition of Chlorella sorokiniana C74

从表3可见，测定出13种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的72%，而且链长集中在C16～C18，其中顺-9，12-十八碳二烯酸（亚油酸），顺-9，12，15-十八碳三烯酸（亚麻酸）含量分别为22.73%和14.87%。亚油酸和亚麻酸是生命代谢的必需脂肪酸，是人体内高度不饱和脂肪酸（EPA和DHA等）的合成前体。有资料显示必需脂肪酸不仅能够吸引水分滋润皮肤细胞，还能防止水分流失，具有改善高血压、预防心肌梗死、预防胆固醇造成的胆结石和动脉硬化的作用。本研究中小球藻富含亚油酸和亚麻酸，可作为人体多不饱和脂肪酸的来源。

2.3氨基酸

研究表示，缺乏氨基酸可以导致人体营养不良，并出现多种不良反应。特别是老年人在缺乏蛋白质的情况下，极容易引起球蛋白和血浆蛋白的降低，导致老年人贫血。

氨基酸样品经高效液相共检测到17种氨基酸，包含7种人体必需氨基酸。另外，色氨酸通过分光光度法测得。氨基酸测定结果兼表4。

从表4可知，小球藻氨基酸含量为17.50%，其中必需氨基酸为6.17%，为总氨基酸的35.26%。

将小球藻必需氨基酸与几种常见食物必需氨基酸进行比较［11］，见表5。

表4　小球藻氨基酸种类与含量Table 4　Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74%

表5 小球藻及常见食物的必需氨基酸含量比较及EAAI值Table 5　The EAA comparation between Chlorella sorokiniana C74 and the common food and EAAI of microalgae with the common food as a reference

由表5可知，小球藻必需氨基酸高于玉米和小麦，低于大豆饼、亚麻仁饼、芝麻饼、鱼粉、猪肉和对虾。与常见食物相比，小球藻EAAI值均超过1，当n=6＞12时，EAAI＞0.95为优质蛋白源，说明小球藻是一种优良的植物蛋白源。

2.4维生素

小球藻中维生素测定结果见表6，小球藻与其它食物中维生素含量的比较如表7所示。

表6 小球藻维生素种类与含量Table 6　Contents of vitamin in Chlorella sorokiniana C74mg/100 g

表7　部分常见食物的维生素含量Table 7　Contents of vitamin in part of the common foodmg/100 g

表6显示小球藻藻粉中含有多种维生素，其中水溶性维生素B1、维生素B3、维生素C以及脂溶性维生素E含量较高，分别为33.81、15.29、27.50、8.84 mg/100 g。表7列出了部分常见维生素食物的维生素含量［12］，通过比较表6和表7可知，小球藻中维生素B1及维生素B3的含量远远高于常规食物，维生素B1和维生素B3含量是分别是淀粉和瘦牛肉的3.75、2.43倍；维生素C的含量丰富，可与韭菜及橙相当；藻粉中维生素A、维生素E的含量较高，分别是鸡蛋黄的1.35倍和1.75倍；小球藻藻粉中维生素B6含量为2.52 mg/100 g，高于常见食品；维生素B12含量低于动物类食品和黄豆，高于其他植物类食品，这是因为植物性食品中多不含维生素B12。Watanabe［13］研究发现可食性藻类富含维生素B12，如：紫菜含有具生物活性之维生素B12，含量为32 μg/100 g～78 μg/100 g干重。

维生素是维持身体健康所必需的一类有机化合物，有研究显示，维生素B1具有保护神经系统的作用；还能促进肠胃蠕动，增加食欲；维生素B2能够促进生长发育和细胞的再生，增进视力；维生素B3促进血液循环，使皮肤更健康，同时还能预防和缓解严重的偏头痛；维生素C具有强的抗氧化能力，能抑制酪氨酸酶的形成，从而达到美白，淡斑的功效，是一种天然的抗氧化剂；维生素E能促进生殖，抗自由基氧化、抑制血小板聚集等多种作用，还对烧伤、冻伤、毛细血管出血、更年期综合症、美容等方面有很好的疗效。本研究中小球藻藻粉维生素种类齐全，含量丰富，且多种成分高于常规食物，是一种天然的优质的维生素来源，加工成食品或保健品对改善维生素缺乏的人群的身体健康状况具有重要的意义。

2.5微量元素及矿物质

小球藻中矿质元素和重金属种类及含量分别见表8和表9。

表8　小球藻矿物质元素种类及含量Table 8　Contents of mineral element in Chlorella sorokiniana C74 mg/kg

表9　小球藻重金属及含量Table 9　Contents of heavy metals in Chlorella sorokiniana C74

由表8、表9可知，小球藻含有丰富的矿物质元素，其中以钾、镁、钙、铁和锌5种元素含量最高，分别为12 305.67、2 064.28、879.0、280.92 mg/kg和78.36 mg/kg。重金属铅、汞、砷、镉的含量均较低，且均远远低于国家食品卫生标准（GB2762-2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》），证明此藻粉是安全无毒害的。小球藻包含有多种人体必需微量元素，如铜、铁、锌、硒、钼、铬、钴及镍等。尽管这些微量元素在人体内含量极小，但它们对维持人体中的一些决定性的新陈代谢却是十分必要的。铁是构成血红蛋白的主要成分之一，缺铁可引起缺铁性贫血；缺硒会引起大骨节病发生，主要发生于青少年，严重地影响骨发育和日后劳动生活能力。国外曾有报道，机体内含铁、铜、锌总量减少会降低免疫能力，助长细菌感染。小球藻富含多种矿物质元素，由此可推断小球藻具有作为人体必需微量元素的重要来源的潜能。

3　结论

小球藻细胞中含有丰富的营养成分，粗蛋白质、多糖、油脂、灰分、粗纤维和色素分别占藻粉干重的20.4%、34.28%、22.16%、12.20%、20.22%和4.50%。小球藻细胞成分的利用除了提取油脂外，还应得到综合利用。例如在提取油脂制备生物柴油后，用于蛋白和多糖的提取，蛋白质可以作为人体或动物食品的蛋白添加，而小球藻多糖具有调节机体免疫、抗肿瘤、抗病毒和抗辐射等多种生物学活性，可开发成保健食品或医药原料。

小球藻除了含有大量的蛋白质、多糖和油脂等营养成分外，还含有多种活性物质，具有较高的综合利用价值。脂肪酸分析显示藻粉中含有多种不饱和脂肪酸，其中包含两种人体必需氨基酸——亚油酸和亚麻酸，含量分别为22.73%和14.87%；氨基酸种类丰富，必需氨基酸含量较高，可以作为人体或动物食品的蛋白来源；维生素含量丰富，尤其是维生素B1、B3和B6，可加工成食品或维生素保健品，改善因维生素缺乏而引起的不良反应；藻粉含有多种生长的必需常量和微量矿物质元素，其中钾、镁、钙、铁和锌5种元素含量较高，重金属铅、汞、砷和镉含量未超标，符合食品安全标准。

总之，小球藻细胞含有多种值得利用的成分，对其利用应不仅局限在制备生物柴油上，对其综合利用也应更加全面。

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Nutrient Analysis of Chlorella sorokiniana C74

ZHANG Ling，LIU Ping-huai*，LUO Ning，CHEN Chen，HE Yi-fei，LI Ang
（Key Study Center of the National Ministry of Education for Tropical Resources Utilization/Ministry of Education Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Determination of Chlorella sorokiniana C74 nutrients，the results showed that Chlorella sorokiniana C74 contains kinds of nutrients，crude protein，carbohydrates，fat，ash，crude fiber and pigment was accounted for 20.4%，34.28%，22.16%，12.20%，20.22%and 4.50%by algae powder dry weight respectively. Fatty acid analysis showed that algae powder contains a variety of unsaturated fatty acids，and linoleic acid and linolenic acid contents were 22.73%and 14.87%.Contents of amino acid in Chlorella sorokiniana C74 was 17.50%，of which the essential amino acids was 6.17%.Through essential amino acid index evaluation，indicating that Chlorella sorokiniana C74 was an excellent source of protein；Chlorella sorokiniana C74 was rich in vitamins，especially vitamin B1，B3and B6.Algae powder contains a variety of trace mineral elements，and potassium，magnesium，calcium，iron and zinc was higher，the heavy metal lead，mercury，arsenic and cadmium was no more than the national standard.

Chlorella sorokiniana；nutritional components；analysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.003

国家科技支撑计划项目课题（2011BAD14B01）；海南省中药现代化科技专项（ZY201327）；国家科技型中小企业技术创新基金（13C26244604892）；海南省产学研一体化项目（CXY20150034）

张玲（1989—），女（汉），硕士研究生，研究方向：微藻生物质能源。
*

刘平怀（1967—），男，教授，药学研究员，主要从事微藻生物质能源及天然产物的研究。

2015-04-07