长白山榛子抗氧化肽制备及其活性研究

李京京，孙文佳，闵伟红，*（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

基础研究

长白山榛子抗氧化肽制备及其活性研究

李京京1，2，孙文佳1，2，闵伟红1，2，*
（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118；2.小麦和玉米深加工国家工程实验室，吉林长春130118）

以长白山榛子分离蛋白为原料，采用碱性蛋白酶制备抗氧化肽，通过Box-Behnken中心组合试验确定最佳水解工艺条件为：酶解温度50℃、加酶量8 000 U/g、底物浓度5.0%、pH9.5。对该条件制备的抗氧化肽进行活性研究，结果显示随着浓度的升高，榛子抗氧化肽在4mg/mL时对ABTS自由基和DPPH清除率均达到100%，8mg/mL时对·OH清除率和总还原能力分别达到85.46%和0.859，12mg/mL时，对Fe2+螯合率达到99.3%。

榛子分离蛋白；抗氧化肽；酶解工艺优化；抗氧化活性

人体过量积累自由基会导致细胞死亡、组织受损、糖尿病和冠状动脉硬化等许多慢性疾病［1-2］。与人工合成的抗氧化剂相比，植物蛋白酶解得到的抗氧化肽，因其易于人体吸收和安全无副作用更受人们的青睐［3-5］。其抗氧化机理包括：为抗氧化酶提供氢、缓冲生理pH、螯合金属离子和捕捉自由基等［6］。

榛子（corylus heterophylla fisch.ex trantv），与扁桃、核桃、腰果并称“四大坚果”，在中国东北地区分布尤为广泛。榛子仁不仅口味佳而且营养价值高，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物以及维生素和多种矿物质。其中脂肪57.1%～62.1%，蛋白质16.2%～21.12%，碳水化合物6.5%～9.3%。榛子仁除可直接食用或添加到食品中外，还可以榨油。目前国内对榛子的研究主要集中在榛子油，榛子果奶以及榛子蛋白等方面［7］。国外对榛子的研究则集中在过敏原方面［8-10］，对蛋白和多肽的研究普遍较少。本试验采用响应面分析法对酶解制备榛子抗氧化肽进行工艺优化，并在此基础上研究其抗氧化活性，为榛子蛋白的充分利用和榛子多肽功能性产品的开发提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

榛子分离蛋白：实验室自制。DPPH、ABTS、菲洛嗪：购于sigma公司；Alcalase 2.4L，碱性蛋白酶：购于丹麦诺维信公司；其他均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

UV-1700型紫外可见分光光度计：日本岛津；SPECTRA-MAX190型酶标仪：美国Molecular Devices公司；ZD-2型自动电位滴定计：上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA224S型分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）仪器有限公司；XMTD-8222型水浴锅：精宏仪器公司；FD-1B-50型冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Z36HK型高速冷冻离心机：德国HERMLE公司。

1.3试验方法

1.3.1榛子抗氧化肽制备

取榛仁分离蛋白粉，加入蒸馏水配成一定底物浓度的溶液，90℃水浴10 min。冷却后调节pH，加入碱性蛋白酶，电位滴定计滴加碱液维持溶液pH恒定。酶解一定时间后，溶液90℃灭酶20 min，冷却至室温，调节pH至7.0，5 000 r/min离心10 min取上清液，冷冻干燥后得到榛仁抗氧化肽。

1.3.2羟基自由基（·OH）清除能力测定

利用Fenton反应，参照Amarowicz的试验方法。

1.3.3响应面法优化榛子抗氧化肽的酶解制备工艺

试验运用Design-Expert 8.0.6.1软件，采用响应曲面法的中心组合设计，以羟基自由基清除能力为指标对酶解条件进行优化。根据单因素试验结果，选出影响较大的4个因素，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，开展四因素三水平的响应面试验，试验因素及水平表见表1。

表1 响应面分析因素水平表Table 1　Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.3.4还原能力测定

参照Lin［12］的试验方法。

1.3.5ABTS清除作用的测定

参照Memarpoor-Yazdi［13］的试验方法。

1.3.6DPPH自由基清除能力测定

参照Wang［14］的试验方法。

1.3.7Fe2+螯合能力测定

参照Yu-Ling Lee［15］的试验方法。

2　结果与分析

2.1响应面试验

2.1.1响应面试验结果及分析

选取底物浓度、酶解温度、pH、加酶量四因素，酶解时间为300 min。酶解制备榛子抗氧化肽工艺的响应面分析试验根据Box-Behnken设计进行了29组试验，其中5组中心点重复试验，结果见表2，回归模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2　Box-Behnken design and results for response surface analysis

以·OH清除率为响应值回归拟合所得各因素函数表达如下：

清除率/%=48.24+1.43X1-3.18X2+5.22X3-0.54X4-2.15X1X2+1.40X1X3-0.95X1X4-1.50X2X3-0.28X2X4-0.80X3X4-2.74X12-4.78X22-4.94X32-3.23X42

由表3方差分析得出P值，模型极显著，模型的失拟性不显著，回归决定系数R2=0.976 7修正决定系数R2Adj=0.953 3，说明方程拟合性较好，可以应用于对酶解条件的分析预测。根据结果进行分析：一次项X1、X2、X3极显著，二次项X12、X22、X32、X42极显著。说明该模型拟合程度良好，用该模型对酶解制备榛子抗氧化肽的工艺进行优化是合适的。

各因素交互作用影响·OH清除率的响应面图见图1。

表3 回归模型方差分析Table 3　Regression and the Analysis of Variance

图1 各因素交互作用影响·OH清除率的响应面图Fig.1　Response surface of mutual influence on scavenging capacities of hydroxyl radical

从图中可以直观地反映各因素对响应值的影响，找出最佳工艺参数以及各参数之间的相互作用。

2.1.2酶解制备榛子抗氧化肽工艺条件的确定及验证

数据分析表明回归模型存在最大值，酶解制备榛子抗氧化肽的最佳工艺条件为：酶解温度52.24℃、加酶量7 741.14 U/g、底物浓度5.22%、pH 9.38。此条件下羟基自由基清除率理论预测最大值为51.74%。采用优化后的最佳工艺条件进行验证试验，同时考虑到实际操作的情况，将条件修正为：pH9.5，温度50℃，加酶量8 000 U/g，底物浓度5.0%，在此条件下做验证试验，得到清除率为50.98%，与模型预测值较为吻合。采用响应面法优化得到的酶解榛子分离蛋白工艺条件比较可靠，具有一定的实用价值。

2.2榛子抗氧化肽粗提物抗氧化活性测定

2.2.1ABTS自由基清除能力测定结果

榛子抗氧化肽对ABTS自由基的清除作用见图2。

图2 榛子抗氧化肽对ABTS自由基的清除作用Fig.2　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with ABTS radical

由图2可知，酶解产物浓度达到3 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率就已经达到96.43%。试验浓度范围内，酶解产物对ABTS自由基清除率在3 mg/mL以后保持在98%～100%，此时酶解产物和VC对ABTS自由基的清除率基本相同，即酶解产物对ABTS自由基的清除率为VC的100%。说明酶解产物对ABTS自由基有较强的清除作用，具有较强的抗氧化活性。

2.2.2DPPH自由基清除能力测定结果

榛子抗氧化肽对DPPH自由基清除能力如图3所示。

图3榛子抗氧化肽对DPPH自由基的清除作用Fig.3　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with DPPH radical

榛子抗氧化肽对DPPH自由基的清除率随浓度的增大而升高，并在2 mg/mL后逐渐稳定，8 mg/mL时达到100%，此时酶解产物和VC对DPPH自由基的清除率一致，即酶解产物对DPPH自由基的清除率为VC的100%。说明酶解产物对DPPH自由基有较强的清除作用，具有较强的抗氧化活性。

2.2.3·OH清除能力测定结果

试验结果如图4所示。

图4　榛子抗氧化肽对羟基自由基的清除作用Fig.4　Scavenging effect of hazelnut antioxidant peptide with hydroxyl radical

榛子抗氧化肽对羟基自由基的清除作用随浓度的增加而显著提高，当浓度为8 mg/mL时，清除率到达85%以上，并在24 mg/mL时达到100%。

2.2.4总还原能力能力测定结果

试验过程中，有还原能力的样品能使铁氰化钾中的Fe3+还原成Fe2+（亚铁氰化钾），产物与FeCl3进一步反应生成在700 nm处有最大吸光峰的普鲁士蓝（Fe4［Fe（CN）6］3），因此测定700 nm处吸光值的高低可以反映样品还原能力的大小，吸光值越大，则还原能力越强。试验结果如5图所示。

图5　榛子抗氧化肽的还原能力作用Fig.5　Reducing power of hazelnut antioxidant peptide

随着浓度的升高，榛子抗氧化肽的还原能力逐渐增强，100 mg/mL时，A700值为1.055，能够达到同浓度下EDTA的38.55%

2.2.5Fe2+螯合能力测定结果

试验结果如图6所示。浓度为10mg/mL时抗氧化肽的螯合率为90.25%，12 mg/mL时达到99.30%。可见榛子抗氧化肽对Fe2+有较好的螯合能力。

图6　榛子抗氧化肽对亚铁离子的螯合作用Fig.6　Ferrous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide

3　结论

本试验以长白山榛子分离蛋白为原料，用碱性蛋白酶酶解，响应面分析法确定最佳水解工艺条件为：酶解温度50℃、加酶量8 000 U/g、底物浓度5.0%、pH 9.5。在此条件下进行酶解，所得得到羟基自由基清除率为50.98%。

对酶解制备的抗氧化肽进行活性研究，考察了·OH、DPPH以及ABTS自由基清除率、Fe2+螯合能力和总还原能力5个指标。结果表明，榛子抗氧化肽随着浓度的升高，对Fe2+螯合率最高能够达到99.3%，对·OH、ABTS的清除率及DPPH的清除率能够达到100%。由此可见榛子抗氧化肽对几种自由基有显著的清除作用，具有较强的抗氧化活性，是一种良好的天然抗氧化剂，拥有广阔的研究价值和市场前景。

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Preparation and Activity of Antioxidant Peptide from Hazelnut in Changbai Mountain

LI Jing-jing1，2，SUN Wen-jia1，2，MIN Wei-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，Jilin，China；2.National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing，Changchun 130118，Jilin，China）

In this experiment，hazelnut nut protein isolated was used as raw material，hydrolyzed by Alcalase to prepare antioxidant peptide.Through Box-Behnken method，the optimal hydrolysis conditions were determined as hydrolysis temperature of 50℃，Alcalase concentration of 8 000 U/g，substrate concentration of 5.0%，hydrolysis pH of 9.5.Assess the antioxidant potential，with the increasing of the peptide solution concentration，scavenging capacities against ABTS and DPPH were 100%at 4 mg/mL，scavenging capacities against hydroxyl radical and reducing power were 85.46%and 0.859 at 8 mg/mL，Ferrous ions chelating capacity of hazelnut antioxidant peptide was 99.3%at 12 mg/mL.

hazelnut protein isolated；antioxidant peptide；enzymatic hydrolysis optimization；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.001

国家“863”计划项目（2013AA102206）

李京京（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：食品科学。
*

闵伟红（1971—），女，教授，博士生导师，主要从事发酵工程、粮油科学与深加工技术研究。

2015-01-22