甲状腺乳头状癌组织中核转录因子-κB的表达及其与临床病理特征的关系

张振华　张荣明

(河南省人民医院甲状腺外科，河南　郑州　450003)



甲状腺乳头状癌组织中核转录因子-κB的表达及其与临床病理特征的关系

张振华张荣明1

(河南省人民医院甲状腺外科，河南郑州450003)

〔摘要〕目的探讨甲状腺乳头状癌(PTC)组织中NF-κB的表达及其与临床病理特征的相关性。方法随机选择2013年2月至2015年6月于该院采取手术治疗的PTC患者68例。取PTC癌组织以及对应的癌旁组织分别进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测、Western印迹检测以及免疫组化检测；分析NF-κB表达与PTC患者病理特征的相关性。结果NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌组织中的表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。PTC癌组织的NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值显著高于癌旁组织(P<0.05)。NF-κB阳性表达在PTC癌组织中主要为阳性及强阳性，而在癌旁组织中则主要为弱阳性，组间差异显著(P<0.05)。 相关性分析发现，NF-κB阳性表达与PTC患者的肿瘤直径、颈淋巴结转移以及TNM分期均呈正相关(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。结论NF-κB在PTC患者组织中呈高表达，且NF-κB的高表达与PTC患者临床病理特征联系密切，在PTC患者疾病进展中扮演着重要的角色。

〔关键词〕甲状腺乳头状癌；核转录因子-κB

乳头状甲状腺癌(PTC)发病率较高，癌灶易发生浸润和转移〔1〕。核转录因子(NF)-κB在机体免疫反应以及炎性反应等多个反应阶段中均起到调控作用。有报道指出NF-κB有助于及时掌握肿瘤患者癌灶转移以及疾病转归等情况〔2〕。本文旨在探讨NF-κB与临床病理特征的关系。

1资料和方法

1.1临床资料随机选择2013年2月至2015年6月于我院采取手术治疗的PTC患者68例，男31例，女37例，年龄41～72〔平均(57.6±1.9)〕岁。TNM分期Ⅰ～Ⅱ 38例，Ⅲ～Ⅳ期 30例。术中切除的PTC癌组织及对应的癌旁组织均保存完整，入选标准：(1)患者的疾病诊断与手术方案均符合世界卫生组织关于PTC的定义与标准；(2)术前并未给予患者放、化疗或免疫制剂类药物治疗。排除标准：(1)其他种类癌症；(2)非手术治疗的PTC患者。

1.2研究方法

1.2.1RT-PCR检测取PTC癌组织以及对应的癌旁组织各0.1 g分别加进1 ml的TRIzol试剂中提取出组织总RNA。再将1 μg的RNA模板经购于Promega公司的反转录试剂盒合成cDNA第一链。将β-actin作为内参，使用TaKaRa公司生产的RT-PCR试剂盒测定NF-κB mRNA的表达量。另取10 μl的RT-PCR扩增产物增添2 μl的6×Loading Buffer，利用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，在GDS800型凝胶成像系统中成像，对所得图像进行灰度分析。其中NF-κB 的扩增引物是5′-AACTGTTCCCCCTCATCTTC-3′及5′-TCCTACAAGCTCGTGGGGGT-3′(269 bp)。β-actin的扩增引物是5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′及5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′(498 bp)。相关反应条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，56℃ 45 s，72℃ 45 s，循环35次，在72℃下延伸约10 min。

1.2.2Western印迹检测取PTC癌组织及癌旁组织各0.1 g，在匀浆离心之后取其上清液，利用考马斯亮蓝G-250检测核蛋白水平，调整至5 μg/L，在-70℃下保存备用。为每个泳道取50 μg的核蛋白，由聚丙烯酰胺凝胶行电泳分离，并电转到PVDF膜。在封闭后，首先加入兔抗人NF-κB型单克隆抗体，而后添加与辣根过氧化物酶相结合的驴抗兔型二抗，利用化学发光试剂盒对杂交信号进行检测。将GAPDH作为内参，通过分析软件给予灰度分析。

1.2.3免疫组化检测使用SP法测定NF-κB的表达情况。4%的多聚甲醛对标本进行固定，经石蜡包埋，切片厚度4 μm，在脱蜡及水化组织切片后，利用0.1%的枸缘酸盐缓冲液行抗原热修复，再进行SP免疫组化染色。使用二甲苯中性树脂进行封固，在显微镜下进行观察。将PBS代替一抗用于阴性对照。将胞质/胞核呈现黄色或棕黄色，以及棕褐色颗粒视为阳性。为每张切片选取5个视野(400×)实施染色细胞评分，染色细胞数在计数细胞中占比<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。染色强度：无染色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。二者乘积0分计阴性(-)，1～4分计弱阳性(+)，5～8分计阳性()，9～12分计强阳性()。

1.3统计学方法应用SPSS16.0软件进行χ2检验、t检验、Pearson分析。

2结果

2.1NF-κB在不同组织中的表达情况NF-κB mRNA及NF-κB 蛋白在PTC癌组织中的表达率〔56例(82.35%)、58例(85.29%)〕显著高于癌旁组织〔18例(26.47%)、23例(33.82%)〕(P<0.05)。

2.2两组NF-κB /β-actin mRNA 以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值比较PTC癌组织的NF-κB /β-actin mRNA(0.91±0.13)以及NF-κB蛋白/GAPDH的灰度比值(9.44±0.38)显著高于癌旁组织(0.38±0.15,1.83±0.25)(t=22.018,137.962,P<0.05)。

2.3不同组织免疫组化结果比较NF-κB阳性表达在PTC癌组织中主要为阳性及强阳性，阳性表达率为86.76%(-9例，+0例，32例，27例)，而在癌旁组织中则主要为弱阳性，阳性表达率为27.94%(-49例，+19例，及均为0例)，组间差异显著(χ2=48.099,P<0.05)。

2.4NF-κB表达与PTC患者病理特征的关系肿瘤直径≥1 cm、有颈淋巴结转移以及TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期者的NF-κB表达阳性率显著高于肿瘤直径<1 cm、无淋巴结转移以及TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期者(P<0.05)。见表1。

表1　NF-κB表达与PTC患者病理特征的关系(n)

2.5NF-κB阳性表达与PTC患者病理特征的相关性分析根据表4分析相关性可知，NF-κB阳性表达与PTC患者的肿瘤直径、颈淋巴结转移以及TNM分期均呈正相关(r=0.667，0.709，0.691；均P<0.05)。

3讨论

NF-κB属于转录因子类型蛋白家族，人体细胞内含Rel、RelB、p65、p52及p50五种亚单位。p65、Rel以及RelB均具有N端同源区和具备反式激活功能的结构域C端，其中同源区中存在一个特定核定位区域，可与DNA相结合，并参与核易位以及二聚体化，而反式激活区域则和转录活化等相关联〔3〕。NF-κB能够参与人体细胞分化、凋亡，产生胚胎组织和免疫以及感染、发生肿瘤等生理性、病理性反应。已有报道，NF-κB在多种肿瘤细胞内存在异常高表达，进一步证实其对于肿瘤浸润以及转移等起到的重要作用〔4〕。

本研究结果充分说明了NF-κB在癌组织中具有更高的表达量。由于NF-κB属于早期型转录因子，其激活无需新翻译蛋白给予调控，当细胞受到有害刺激时，其能够立即给予反应〔5〕。因此，当细胞膜表面出现有害刺激和受体相结合情况时，可以使NF-κB自身信号通路发生改变，进而表达。而PTC组织内通常具有大量炎性因子，且其微环境通常处于缺氧状态，因此会刺激NF-κB活化，并向核内部转移〔6〕。病毒编码类型癌蛋白也会导致NF-κB激活，进而造成患者NF-κB水平高表达。NF-κB自身通路激活能够促进肿瘤细胞发生以及发展，进一步印证其对肿瘤癌变所起到的关键作用。主要表现为NF-κB活化高表达，其抗凋亡通路得到充分表达，能够使细胞凋亡因子以及周期调节类蛋白表达水平受到抑制而呈低表达状态，导致肿瘤细胞避免了凋亡机制，形成克隆能力而不断增殖〔7〕。Lin等〔8〕报道提出，血管内皮生长因子是能够促进血管不断形成的因子，其对于肿瘤发生以及转移均起到关键作用。而NF-κB对于其具有明显调控作用，当NF-κB水平上升时，其水平得到显著上调，造成肿瘤血管大量形成，且NF-κB激活之后还会导致控制PTC发生高转移的细胞因子表达水平上升，进而促进癌细胞转移。因此，NF-κB激活直接影响PTC的生长及转移。同时，相关性分析结果再次表明NF-κB阳性表达与患者的临床病理特征存在较大的联系，值得深入研究。

4参考文献

1樊玉霞，刘洋，刘征，等.核转录因子-κB信号通路对甲状腺乳头状癌细胞生物学行为的影响〔J〕.中华实验外科杂志，2015；32(8)：1866-8.

2石建华，汪万英，李阳，等.MMP-9、TIMP-1和NF-κB在甲状腺乳头状癌中的表达及意义〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2010；26(2)：129-31.

3何雅静，孟召伟，谭建，等.小干扰RNA抑制核因子-κB增强131I治疗甲状腺癌疗效的研究〔J〕.中华核医学与分子影像杂志，2013；33(3)：207-12.

4董鸿，晏昱婧，沈文状，等.儿童及青少年甲状腺癌特点及颈淋巴结转移风险因素探讨〔J〕.现代生物医学进展，2015；15(18)：3544-7.

5Pyo JS，Sohn JH，Kang G，etal.Characteristics of neck level Ⅳ lymph nodes in papillary thyroid carcinoma：correlation between nodal characteristics and primary tumor〔J〕.Endocr Pathol，2015；26(1)：15-20.

6Pyo JS，Kang G，Kim DH，etal.Activation of nuclear factor-κB contributes to growth and aggressiveness of papillary thyroid carcinoma〔J〕.Pathol Res Pract，2013；209(4)：228-32.

7Bommarito A，Richiusa P，Carissimi E，etal.BRAFV600E mutation，TIMP-1 upregulation，and NF-κB activation：closing the loop on the papillary thyroid cancer trilogy〔J〕.Endocr Relat Cancer，2011；18(6)：669-85.

8Lin CI，Du J，Shen WT，etal.Mitogen-inducible gene-6 is a multifunctional adaptor protein with tumor suppressor-like activity in papillary thyroid cancer〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2011；96(3)：E554-65.

〔2015-12-10修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)

基金项目：辽宁省自然科学基金项目(No.2014022035)

通讯作者：张荣明(1974-)，男，硕士，教授，主要从事烧伤整形研究。

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)13-3198-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.13.050

1辽宁医学院第一附属医院

第一作者：张振华(1974-)，男，硕士，主治医师，主要从事甲状腺外科研究。