硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠黏膜组织形态和免疫细胞的影响

张芮琪，罗启慧，陈正礼

(四川农业大学 动物医学院 实验动物疾病模型研究室，四川 成都 611130)



硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠黏膜组织形态和免疫细胞的影响

张芮琪，罗启慧，陈正礼

(四川农业大学 动物医学院 实验动物疾病模型研究室，四川 成都 611130)

[摘要]【目的】 制备硫酸化黄芪多糖(Sulfated astragalus polysaccharide，sAPS)，研究其对雏鸡十二指肠组织发育及黏膜免疫相关细胞分布的影响。【方法】 采用氯磺酸-吡啶法对黄芪多糖(Astragalus polysaccharid，APS)进行硫酸化修饰，制备sAPS，氯化钡-明胶浊度法测定sAPS中硫含量，并计算sAPS的硫酸基取代度。运用组织学制片技术和染色方法分别观察APS及sAPS干预后7 d和14 d鸡十二指肠的组织学特点，对肠壁黏膜层上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocytes，IEL)、柱状上皮细胞间杯状细胞(Goblet cells，GC)和肠壁内肥大细胞(Mast cells，MC)数量进行统计分析。【结果】 制得的sAPS中硫含量为14.3%，计算得到sAPS的硫酸基取代度为1.325。给予APS和sAPS干预后，sAPS组雏鸡十二指肠的绒毛高度及绒毛高度/隐窝深度比值均明显高于对照组和APS组，隐窝深度明显低于对照组和APS组，sAPS组黏膜上皮内淋巴细胞、杯状细胞及肠壁肥大细胞的数量也明显高于对照组和APS组。【结论】 sAPS对雏鸡十二指肠组织发育及肠道黏膜免疫的促进作用较APS强。

[关键词]黄芪多糖；硫酸化修饰；十二指肠黏膜；黏膜免疫；雏鸡

近年来，针对中药多糖的免疫药理学研究成为热点，中药多糖具有促进免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗辐射、抗衰老及抗寄生虫等多种生物活性，对促进机体特异性免疫与非特异性免疫都有广泛的影响。有些植物多糖如芦荟多糖、大枣多糖及人参茎叶多糖等还可促进动物肠道的发育[1-3]。同时，多糖为天然产物，具有毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，因而应用前景广阔。近年来的研究证实，中药多糖经分子修饰后其药理活性有所增强，而硫酸化修饰是中药多糖分子修饰方法中应用最广泛、最普遍的一种修饰方法。目前，一般采用氯磺酸-吡啶法、浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等对中药多糖的支链残基进行硫酸化修饰[4]。研究表明，经硫酸化分子修饰后，中药多糖的免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等生物活性明显增强[4-8]。

黄芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)是黄芪的主要有效成分，其具有调节免疫、抑制病毒、抗衰老等作用[9]。近年来，黄芪多糖因其显著的免疫增强和抗病毒效应，加上来源丰富、价格低廉、毒性较低以及无耐药性等[10]特性，而广泛应用于兽医临床、畜牧及水产动物的养殖中。本试验采用氯磺酸-吡啶法对黄芪多糖进行硫酸化修饰，通过体内试验进一步研究硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠组织发育及黏膜免疫相关细胞分布的影响，以期为黄芪资源的开发和综合利用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试多糖黄芪多糖，购自陕西宝鸡方晟生物开发有限公司。

1.1.2试验动物与饲养管理1日龄非免疫罗曼公鸡60只，购自四川省天全县隆生集团孵化场，饲喂日粮为绵阳正大小鸡配合饲料。试验鸡采用立体笼养，自由采食和饮水。

1.1.3主要试剂与仪器苏木色精、甲苯胺蓝(上海蓝季科技发展有限公司)，碱性品红(Solarbio公司)，伊红(醇溶性，Solarbio公司)。LEICA RM 2126型旋转石蜡切片机(徕卡仪器有限公司)，Motic数码显微镜(厦门麦克奥迪实业有限公司)，电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)，GTK-2002自动摊片烤片机(西安瑞丰仪器设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1黄芪多糖的硫酸化修饰采用氯磺酸-吡啶法[11]进行，根据文献[12]确定黄芪多糖的硫酸化条件为：反应温度95 ℃，V(氯磺酸)∶V(吡啶)=1∶6、反应时间1 h。反应完成后，将反应产物加入到100 mL预冷的蒸馏水中，用5 g/L的NaOH调节pH至7.0，用3倍体积的无水乙醇沉淀静置24 h。取沉淀装入透析袋，用自来水透析48 h，蒸馏水透析24 h，透析液经冷冻干燥得到sAPS。采用氯化钡-明胶浊度法[11]测定sAPS中硫含量,计算硫酸基取代度(degree of substitution,DS)(指多糖中每个糖单位上的活性羟基被硫酸根所取代的数量)：DS=(1.62×S硫含量)/(32-1.02×S硫含量)。

1.2.2动物分组及处理将1日龄罗曼公鸡饲养至14日龄，随机分为5组，每组12只，对照组(CK)饲喂基础日粮，其余4个试验组分别饲喂在基础日粮中添加高(500 mg/kg)、低(300 mg/kg) 剂量黄芪多糖(高剂量组表示为APSH，低剂量组表示为APSL)和高(500 mg/kg)、低(300 mg/kg) 剂量硫酸化黄芪多糖(高剂量组表示为sAPSH，低剂量组表示为sAPSL)的日粮，试验期14 d，常规饲养管理。

1.2.3样品采集分别于给药后的7 d(即21日龄)和14 d(即28日龄)，每组随机选取6只雏鸡，颅面动脉放血致死，迅速取十二指肠，用新配制的生理盐水冲洗，放入Bouin’s液中固定48 h以上。

1.2.4肠壁组织形态观察固定好的十二指肠组织按常规组织学方法制备石蜡切片，肠管连续横切，制得3套切片，分别行HE染色、PAS染色和肥大细胞甲苯胺蓝染色。

肠道形态观察参照Fleming等[13]的方法进行，具体步骤：挑选5张染色清晰的切片，每张切片选取10根最长且走向平直、伸展良好的绒毛，通过Motic数码显微图像处理系统进行定量分析，测量其绒毛高度(Villum heigh，VH)及与之相连的隐窝深度(Crypt depth，CD)，并计算绒毛高度与隐窝深度之比值(VH/CD)。十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞(Intraepithelial lymphocyte，IEL)、杯状细胞(Goblet cell，GC)和肥大细胞(Mast cell，MC)数量的统计参考文献[14]介绍的方法进行。

1.3数据统计分析

试验数据均以“平均值±标准差”表示，用SPSS 17.0统计软件的One Way Anova程序进行统计，比较各组雏鸡十二指肠绒毛高度、隐窝深度及二者比值，以及肠壁组织内黏膜免疫相关细胞(IEL、GC和MC)数量的差异，以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2结果与分析

2.1黄芪多糖的硫酸化修饰

经测定，本试验得到的硫酸化黄芪多糖产物sAPS中硫含量为14.3%，根据公式计算，得到该硫酸化黄芪多糖产物sAPS的硫酸基取代度是1.325。

2.2硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠发育的影响

给药后7 d，sAPS组、APS组和对照组雏鸡十二指肠绒毛分布均匀、排列整齐，隐窝较浅，镜下差异不大；给药后14 d，sAPS组和APS组雏鸡十二指肠绒毛高度较对照明显增大，但其隐窝深度均小于对照组。经Nikon数码显微图像处理系统测量各组雏鸡的绒毛高度(VH)及与之相连的隐窝深度(CD)，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值(VH/CD)，结果如表1 所示。由表1可知，21 d时高、低剂量的APS和sAPS组雏鸡十二指肠绒毛高度、隐窝深度均显著(P<0.05)高于对照组， APSH和高、低剂量的sAPS组绒毛高度与隐窝深度比值均显著高于对照组(P<0.05)。28 d时，APS组雏鸡十二指肠绒毛高度显著高于对照组(P<0.05)，而隐窝深度显著低于对照组(P<0.05)；高、低剂量的sAPS组雏鸡十二指肠绒毛高度均显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)，其隐窝深度均极显著低于对照组(P<0.01)；APS、sAPS组绒毛高度与隐窝深度比值分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于对照组。上述结果表明，硫酸化修饰后的黄芪多糖明显提高了雏鸡十二指肠的绒毛高度、降低了隐窝深度，从而使绒毛高度与隐窝深度比值明显增大。

表 1　硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠绒毛高度、隐窝深度及二者比值的影响Table 1　Effect of sulfated astragalus polysaccharide (sAPS) on villus height (VH), crypt depth (CD) and VH/CD ratio in chicken duodenum

注：*表示与对照组相比差异显著(P<0.05)；**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。下表同。

Note:Compared with the control group,“*” means significant difference (P<0.05),and “**” means extremely significant difference (P<0.01).The same below.

2.3硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量的影响

HE染色可见，黏膜上皮内杯状细胞(GC)呈高脚玻璃杯状，细胞质着色浅淡，细胞核位于细胞基部；黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)则散布于柱状细胞之间，细胞核圆形、大而深染；PAS染色后，杯状细胞细胞质呈紫红色。对各组雏鸡十二指肠黏膜上皮中淋巴细胞和杯状细胞的数量进行统计分析，结果如表2所示。

由表2可知，21 d时APSH和sAPSL组雏鸡黏膜上皮内淋巴细胞(IEL)数量均显著高于对照组 (P<0.05)，sAPSH组IEL数量极显著高于对照组(P<0.01)；sAPSH组黏膜上皮内杯状细胞(GC)数量显著(P<0.05)高于对照组。28 d时，APS组雏鸡黏膜上皮内淋巴细胞数量均显著高于对照组(P<0.05)，而sAPS组雏鸡IEL数量均极显著高于对照组(P<0.01)，APSH组GC数量显著(P<0.05)高于对照组，高、低剂量的sAPS组GC数量均极显著(P<0.01)高于对照组。这充分说明，APS、sAPS的添加均可通过刺激IEL和GC数量的增加来增强肠道黏膜免疫与防御屏障。

表 2　硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠黏膜上皮内淋巴细胞和杯状细胞数量的影响Table 2　Effect of sAPS on number of intraepithelial lymphocytes (IEL) and goblet cells (GC) in duodenum epithelium mucosa of chicken

注：细胞计数方法：以统计100个黏膜上皮柱状细胞间IEL和GC的数量为准。

Note:Cell counting method: the number of GC and IEL were counted between 100 columnar cells in epithelium mucosa.

2.4硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠肠壁肥大细胞数量的影响

十二指肠壁中肥大细胞主要位于肠壁的黏膜固有层和黏膜下层，少量散布于肌层之间。肥大细胞呈圆形或卵圆形，经甲苯胺蓝染色后，细胞质内充满蓝紫色颗粒，细胞核呈空泡状、弱嗜碱性。对各组雏鸡十二指肠肠壁中肥大细胞进行计数和统计分析，结果如表3所示。

表 3　硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠肠壁肥大细胞数量的影响Table 3　Effect of sAPS on number of mast cells (MC) in chicken duodenum wall

由表3可知，21 d时APSH和高、低剂量的sAPS组肠壁肥大细胞数量均显著高于对照组 (P<0.05)；28 d时APSL组肠壁肥大细胞数量显著高于对照组 (P<0.05)，而APSH组和高、低剂量的sAPS组肠壁肥大细胞数量均极显著高于对照组 (P<0.01) 。由此可以看出，APS和sAPS的添加均可显著增加肥大细胞的数量，从而加强肠道黏膜免疫。

3讨论

3.1硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠黏膜形态的影响

动物小肠壁的腔面从大到小依次形成环形皱襞、小肠绒毛和上皮细胞微绒毛(纹状缘)等三级可增大小肠黏膜吸收表面积的微细结构，其中环形皱襞是由黏膜和黏膜下层突向管腔形成的永久性结构，小肠绒毛则是黏膜上皮和固有膜突向管腔所形成的指状突起，而肠绒毛的表面是密集微绒毛组成的纹状缘[15]。小肠的绒毛高度、肠隐窝深度、绒毛高度与隐窝深度比值及绒毛表面积是目前用于衡量小肠消化和吸收功能的重要指标。绒毛变短，其所含肠黏膜上皮中柱状细胞数量减少，预示对营养物质的消化吸收能力降低；肠隐窝则是肠绒毛基部上皮向固有层内下陷形成的单管状腺体结构，其深度的增减提示隐窝细胞生长速度的快慢，在一定程度上可影响机体的消化吸收机能[16]。而绒毛高度与隐窝深度比值可更好地反映小肠黏膜的吸收功能状况，两者比值的降低提示肠壁黏膜受损，机体的消化吸收功能降低而影响机体的生长发育；比值升高则表明黏膜得到修复改善，机体消化吸收功能得以增强而促进机体的生长发育[17]。有研究表明，植物多糖可促进动物肠道组织的发育。王留等[2]的研究显示，饲料中添加大枣多糖能够促进仔猪肠道内双歧杆菌和乳酸杆菌的繁殖，并可通过显著增加仔猪小肠各段的绒毛长度和降低肠道的隐窝深度提高肠道的消化吸收能力。给仔猪日粮中添加芦荟多糖后可提高十二指肠段、空肠前段和空肠后段的绒毛高度[1]。张勇等[18]的研究也证实，在雏鸡饲料中添加不同剂量的黄芪多糖能增加肉鸡十二指肠绒毛高度、降低隐窝深度。本研究结果表明，日粮中添加黄芪多糖和硫酸化黄芪多糖后7和14 d，各试验组雏鸡十二指肠绒毛高度均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组；当添加后14 d时各组隐窝深度显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)低于对照组；当添加7和14 d时，除7 d APSL组外，其他组雏鸡十二指肠绒毛高度及隐窝深度比值也均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组；统计结果显示，与对照组相比，硫酸化修饰后黄芪多糖明显提高了雏鸡十二指肠的绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度的比值，显著降低了隐窝深度，表明黄芪多糖和硫酸化黄芪多糖干预在一定程度上能促进雏鸡十二指肠对营养物质的吸收，从而有利于雏鸡的生长发育。

3.2硫酸化黄芪多糖对雏鸡十二指肠肠壁组织内黏膜免疫相关细胞分布的影响

肠道黏膜及黏膜下层存在大量的淋巴细胞和肥大细胞，它们与黏膜上皮内杯状细胞一起发挥重要的黏膜免疫功能。肥大细胞广泛存在于机体各处的结缔组织中，除了参与机体的过敏和炎症反应外，在先天性免疫和获得性免疫中也发挥着重要作用，因此肥大细胞也是机体中一种重要的免疫活性细胞[19]。肠黏膜上皮中杯状细胞的主要功能是分泌黏液(成分主要为黏蛋白)，对小肠黏膜上皮具有保护和润滑作用，其分泌的黏蛋白以及柱状细胞分泌的复合糖蛋白共同形成黏膜表面的糖衣，后者与膜分子构型中的蛋白质和脂质牢固嵌合，形成黏膜表面一道重要的物理屏障。肠黏膜柱状上皮内淋巴细胞作为黏膜表面最早接触外来抗原的免疫活性细胞，是黏膜免疫屏障的主要组成部分[20]，上皮内淋巴细胞数量增加是机体肠道黏膜免疫功能状态有所提高的反映。有资料报道，日粮中添加0.20%和0.25%的银杏叶提取物可显著提高十二指肠上皮内淋巴细胞、肥大细胞以及杯状细胞的数量，进而有助于增强肉仔鸡十二指肠的黏膜免疫功能[21]。黄玉章等[22]研究表明，日粮中添加黄芪多糖可显著增加罗非鱼肠道黏液细胞和上皮内淋巴细胞的数量，表明饲料中添加黄芪多糖可以提高罗非鱼机体的特异性免疫功能。本试验结果显示，日粮中添加APS和sAPS后7 d，高剂量APS组和sAPS组雏鸡黏膜上皮内淋巴细胞数量均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，sAPSH组黏膜上皮间杯状细胞数量显著(P<0.05)高于对照组；添加多糖后14 d，各试验组雏鸡黏膜上皮内淋巴细胞均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组，APSH和sAPS组雏鸡黏膜上皮间杯状细胞均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组。多糖干预后7 d，APSH和sAPS组雏鸡十二指肠肠壁肥大细胞数量均显著高于对照组(P<0.05)；14 d时APSL组肠壁肥大细胞数量显著高于对照组(P<0.05)，而APSH和sAPS组肠壁肥大细胞数量均极显著高于对照组(P<0.01)。结果表明，硫酸化黄芪多糖可通过显著增加雏鸡十二指肠肠壁组织黏膜免疫相关细胞(IEL、GC和MC)的数量提高其黏膜免疫屏障功能。

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DOI：网络出版时间:2016-06-0816:2110.13207/j.cnki.jnwafu.2016.07.010

[收稿日期]2015-11-04

[基金项目]国家科技支撑计划项目(2014BAI03B01)；国家重大科学仪器设备开发专项(2013YQ49085906)；四川省青年科技创新研究团队项目(2013TD0015)

[作者简介]张芮琪(1994-)，女，山西芮城人，本科在读，主要从事实验动物疾病模型研究。E-mail:380779444@qq.com [通信作者]陈正礼(1975-)，男，四川简阳人，教授，博士生导师，主要从事实验动物疾病模型研究。E-mail:chzhli75@163.com

[中图分类号]S852.16+2

[文献标志码]A

[文章编号]1671-9387(2016)07-0064-06

Influence of sulfated astragalus polysaccharide on histology and immune cells of duodenum mucosa of chicken

ZHANG Ruiqi,LUO Qihui,CHEN Zhengli

(LaboratoryofAnimalDiseaseModel,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

Abstract:【Objective】 This study prepared the sulfated astragalus polysaccharide (sAPS) and evaluated its effect on duodenum histology and mucosal immunity related cells.【Method】 Sulfated modification of astragalus polysaccharide (APS) was done by chlorosulfonicacid-pyridine method,sulfur content of sAPS was detected by Barium chloride-gelatin turbidity method,and degree of substitution (DS) was calculated.The histological structure of duodenum,distribution of both intraepithelial lymphocytes (IEL),goblet cells (GC) in mucosa and mast cells (MC) in whole intestinal wall were observed using common histological technologies on days 7 and 14 after the polysaccharide treatment.【Result】 The sulfur content of sAPS was 14.3% and its DS was 1.325.Compared with the blank control group and APS group,sAPS increased the villus height (VH) and the ratio of villus height to crypt depth (VH/CD),while decreased the crypt depth (CD).The numbers of IEL,GC in mucosa and MC in whole intestinal wall were also increased.【Conclusion】 The role of sAPS in prompting duodenum development and enhancing intestinal mucosal immunity of chicken was stronger than that of APS.

Key words:astragalus polysaccharide;sulfated modification;duodenal mucosa;mucosal immunity; chicken

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160608.1621.020.html