构建含5-氟尿嘧啶的自组装短肽原位水凝胶的初步流变学研究

唐富山，孟　翠，杨春先，原凌燕

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义　563099；2.遵义医学院 护理学院，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

构建含5-氟尿嘧啶的自组装短肽原位水凝胶的初步流变学研究

唐富山1，孟翠1，杨春先1，原凌燕2

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义563099；2.遵义医学院 护理学院，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 探讨构建含5-氟尿嘧啶(5-Fu)的自组装短肽RAD16-I原位水凝胶的可能性。方法 采用流变仪测量短肽水溶液与磷酸盐缓冲液(PBS)混合前后的储存模量、损耗模量、相位角等流变学参数，表征含5-Fu的RAD16-I水溶液在模拟生理条件下形成水凝胶的情况；通过倒置显微镜观察含5-Fu的RAD16-I水溶液加入细胞培养基后形成的水凝胶及细胞的形态，考察含5-Fu 的RAD16-I溶液在细胞培养基中形成水凝胶、维持凝胶状态的情形和水凝胶中药物对细胞的作用。结果 不含和含5-Fu的RAD16-I水溶液在PBS或细胞培养基中均能形成凝胶，凝胶呈透明的膜片状，在培养基中与细胞共处时，含药水凝胶较好地维持其凝胶状态和5-Fu的抗肿瘤效果。结论 自组装短肽可以作为5-Fu等抗肿瘤药物的载体材料加以开发。

[关键词]自组装短肽; 5-氟尿嘧啶; 原位凝胶; 流变学; 药物载体材料

为提高抗肿瘤药物的疗效并降低不良反应，除口服和静脉用药外，局部或腔内途径实施抗肿瘤药物给药的研究方兴未艾[1-3]，以不同材料构建抗肿瘤药物的原位凝胶给药系统是其中一个重要的研究分支[4-5]。近年来，不少研究者都意识并关注载体材料对主药活性的影响[6]以及所涉及的给药体系的生物安全性问题[7]。由于结构设计简单可控、自组装特性和生物相容性良好，离子互补型自组装短肽得到许多新型生物材料领域研究者的注意[8-10]，在生物医药领域探讨开发自组装短肽为药物载体的研究是其中颇具特色的部分[11-12]。已有研究表明，离子互补性自组装短肽不仅能作为胶体稳定剂表现出水难溶性药物载体的潜力[13-14]，而且在体液离子强度和/或pH条件下能够迅速形成具有一定机械强度的水凝胶而显示出具有成为药物原位水凝胶载体的潜力[15]。本文采用临床常用且抗肿瘤疗效较为显著的5-氟尿嘧啶(Fluorouracil，5-Fu)为模型[16]，初步探讨自组装短肽原位水凝胶用作抗肿瘤药物局部给药载体的可能性。

1材料与方法

1.1仪器与药品流变仪，AR200ex，TA instruments, USA；恒温金属浴，CHB-100，杭州博日科技有限公司。

RAD16-I(Ac-RADARADARADARADA-CONH2)，上海波泰公司商业合成，纯度≥98%，溶解于水配成1%(w/v)，临用前稀释为所需浓度；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)，批号为0373B11，AMRESCO产品，生工生物工程(上海)有限公司分装。

乳腺癌细胞株，MDA-MB-435S，四川大学纳米生物医学与膜生物学研究所保存；L-15培养基、胎牛血清，美国invitrogen公司。

其余试剂为分析纯，溶液配制用超纯水。磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4)按照中国药典方法配制。

1.2试验方法

1.2.1自组装短肽形成原位水凝胶的流变学试验由1%RAD16-I水溶液稀释而得0.1%、0.2%、0.5%的短肽水溶液，含5-Fu的不同RAD16-I浓度的水溶液由1% RAD16-I水溶液和5-Fu水溶液混合并稀释而得，并分别取适量稀释后溶液与等体积PBS混合。采用流变仪来测量不同浓度的短肽水溶液与PBS混合前后的储存模量G′、损耗模量G″和相位角Δ。测量用夹具直径20 mm，不锈钢锥板锥度1o，平截25 μm。应变设为固定的0.5%。频率扫描(frequency sweep test)时频率范围设为0.1～100 Hz，时间扫描(time sweep test)时频率设为1.0 Hz。加盖防止溶液挥发，帕耳贴板控温系统控制温度为25 ℃。每次测量用70 μL样品。

1.2.2细胞培养基中自组装短肽原位水凝胶的观察二维细胞贴壁达80%时，胰酶消化，离心(1 000 rpm，5 min)，细胞计数，细胞终浓度为1×104/孔，接种于96孔板培养。置37 ℃培养箱培养，在分别培养1 d后，更换培养基，加入含抗肿瘤药物的RAD16-I溶液，置于培养箱培养，分别于24、48 h观察水凝胶和细胞的状态，包括水凝胶的形状、透明程度、凝胶状态的维持情况以及不同给药情形下培养基或水凝胶中肿瘤细胞的细胞密度、细胞形状。

2结果

2.1含抗肿瘤药物的RAD16-I溶液形成原位水凝胶的特性表1结果表明, 在不含药物的RAD16-I水溶液中，G′近似或略大于G″，G′和G″随短肽浓度增加变化很小；当加入等体积PBS后，尽管短肽的浓度实际上下降了1/2，但与加入PBS前相比，G′显著增大且增加幅度随短肽浓度增加而增加(P<0.01)，G″也有增加但增加幅度比G′小很多(P<0.01)，Δ显著变小(P<0.01)。在不含药物的短肽浓度均为0.5%(w/v)的RAD16-I溶液加入PBS后，表示弹性的G′增加了107倍(见表1)。

含5-Fu的RAD16-I与不含药物的RAD16-I水溶液中有所不同。在0.1%短肽浓度下，加入PBS后G′和G″均减小(P<0.05)，但Δ值变化无统计学意义(P>0.05)；在0.2%短肽浓度下，加入PBS前后，各流变学参数均无显著变化 (P>0.05)；在0.5%短肽浓度下，加入PBS后G′和G″均大幅增加(P<0.01)，Δ值增加(P<0.05，见表1)。由图1可知，加入PBS后与加入前相比，G′和G″均显著增加；然而，在频率为10 Hz以下时，G′随频率变化的变化幅度都很小，且在不同频率下G′均远大于G″。说明5-Fu的水溶液也能像PBS一样使RAD16-I溶液成水凝胶或使水凝胶的机械强度增加。

2.2细胞培养基中的自组装短肽原位水凝胶图2所示为不含药物和含5-Fu的RAD16-I溶液在细胞培养基中形成的原位水凝胶经过与细胞共同孵育48 h的显微镜照片。可见，不含和含5-Fu的RAD16-I均能在培养基中形成凝胶，水凝胶呈透明膜片状；在未更换培养基情况下，水凝胶与细胞共处48 h时仍然很好地保持其存在状态。图3所示的显微镜照片分别表示含5-Fu的RAD16-IΔ、G′和G″分别为流变学参数相位角、储存模量和损耗模量，Δ的正切值等于G″与G′之比。表中数据为在1 Hz频率和固定应变0.5%的条件下，对不含和含五氟尿嘧啶(5-Fu)的RAD16-I溶液与等体积PBS混合前后分别进行时间扫描的流变学参数。在与PBS混合前5-Fu浓度为2.05 mg/mL。R：不含药物的RAD16-I水溶液；RP：R与等体积PBS混合后；RF：含5-Fu的RAD16-I溶液；RFP：RF与等体积PBS混合后。a: 与“R”组相比，P<0.01；b: 与“RF”组相比，P<0.01；c: 与“RF”组相比，P<0.05；d：与“RP”组相比，P<0.01；e: 与“RP”组相比，P<0.05。

组别RAD16-I浓度0.1%ΔG'G″0.2%ΔG'G″0.5%ΔG'G″R47.47±3.350.61±0.040.14±0.0127.57±1.891.37±0.120.39±0.0213.92±1.01 4.25±0.441.05±0.12RP5.89±0.68a16.56±1.24a1.71±0.12a7.18±0.35a101.22±9.17a12.77±1.42a5.05±0.31a458.65±28.97a40.49±3.98aRF7.43±0.57ae40.73±4.22ad5.31±0.65ad7.59±0.54a91.52±7.21a12.19±1.20a3.30±0.98ae61.33±5.68ad3.54±0.31adRFP6.69±0.82a28.87±2.77ac3.38±0.49ac7.67±0.68a91.84±7.52a12.37±1.31a6.32±2.28ac1065.32±60.21ab118.09±9.77ab

在固定应变0.5%的条件下，对与等体积PBS混合前后的含5-Fu的RAD16-I溶液进行频率扫描。在与PBS混合前RAD16-I浓度为0.5%(w/v)，5-Fu浓度为2.05 mg/mL。△、▲分别表示混合前后的储存模量(G′)，○、●分别表示混合前后的损耗模量(G″)。　　图1　含抗肿瘤药物(5-Fu)的RAD16-I原位水凝胶的流变学特征

溶液在培养基中形成的原位水凝胶作用细胞24和48 h细胞的生长状况，含药物水凝胶的培养基中细胞与加入药物水溶液的培养基中细胞从细胞密度、细胞形状等对比，生长状况相似：空白对照和不含5-Fu的自组装短肽组中，24和48 h的细胞密度均较高、细胞形状均饱满完整；而含5-Fu水凝胶的培养基中细胞在24 h时细胞密度明显下降、细胞形状尚饱满，到48 h时不仅细胞密度下降、而且细胞多数呈现皱缩状。表明水凝胶形成后保持了所加载药物固有的抗肿瘤效果。

A：不含5-Fu的0.2%RAD水凝胶；B：含5-Fu的0.2%RAD水凝胶。混合后48 h拍摄。　　图2　细胞培养基中RAD16-I水凝胶的显微镜照片(×200)

1：24 h的结果；2：48 h的结果。A：空白对照；B：0.2%RAD；C：0.5%RAD；D：5-Fu水溶液；E：含5-Fu的0.2%RAD；F：含5-Fu的0.5%RAD。5-Fu浓度(培养基+水凝胶整体体系中)为150 μg/mL。图3　RAD16-I水凝胶作用细胞24和48 h后的细胞照片(×200)

3讨论

3.1含抗肿瘤药物的RAD16-I溶液原位成水凝胶的特性水溶液具有的粘弹性，可用储存模量(G′)和损耗模量(G″)的大小和对频率的依赖性来表征[17-18]。代表材料弹性特征的G′值增加意味着材料特性更接近于弹性固体；代表材料粘性特征的G″值增加意味着材料特性更接近于粘性液体；以G″/G′比值为正切的相位角(Δ值)的增加意味着材料在相对粘弹性上趋向于粘性液体，Δ值的减小提示材料更趋向于弹性固体。

流变学测定结果表明，在不含药物的RAD16-I水溶液中， G′近似或略大于G″，G′和G″随短肽浓度增加变化很小；当加入等体积PBS后，G′显著增大且增加幅度随短肽浓度增加而增加，G″也有增加，但增加幅度比G′小许多，相位角显著变小。这表明，不含药物的RAD16-I溶液在与PBS接触后与接触前相比，体系行为特性由更接近于粘性液体向更接近于弹性体转变，表示溶液中粒子间相互缔合、溶液中分子链之间的缠绕作用较强，已处于聚集状态，表现出一定的机械强度；较低频率时机械弹性且随频率变化不明显，表明溶液中形成了典型的交联网络结构，即自组装短肽RAD16-I在接触到PBS后能够迅速形成具有一定机械强度的水凝胶。而含5-Fu的RAD16-I水溶液情况有所不同。在0.1%和0.2%短肽浓度下，加入PBS前后，各个流变学参数均无显著变化；在较高短肽浓度下，加入PBS后储存模量增加，但G″也相应增加，耗损角值反而轻微增加。说明5-Fu的水溶液也能像PBS一样使得RAD16-I溶液成水凝胶或使水凝胶的机械强度增加。这可能与5-Fu具有一定的水溶性、结构中含两个氮原子有关，即5-Fu水溶液与RAD16-I水溶液混合后，可以由于离子强度和pH的变化而表现出轻度成水凝胶的趋势。具有5-Fu这样性质的药物可以采取双通道导入方式在需要的部位成水凝胶。当然，在较高短肽浓度的含5-Fu水溶液中，PBS的介入，使得代表弹性的G′和代表粘性的G″均显著增加，这在某些同时需要机械强度和流动性的情况下也许比较有用。

3.2细胞培养基中的自组装短肽原位水凝胶原位水凝胶在目的作用部位的保持时间与所加载药物的作用发挥有关。因而，在有细胞生长的培养基中，水凝胶的存在状态和保持时间是否稳定持久，可以说是原位水凝胶能否体内应用的重要指标。含和不含药物的RAD16-I均能在培养基中形成凝胶并在一定时间内保持其存在状态，且水凝胶形成后保持了其中所加载药物固有的抗肿瘤效果。

化疗药物给药方法探索是肿瘤研究的重要主题，而运用各种材料构建原位凝胶是促进肿瘤化疗高效低毒的一种实用方法[1-3]，自组装短肽由于其良好的生物相容性和成胶性能成为有前景的药物载体材料[8,11]。本文所报道的含有5-Fu的RAD16-I水溶液在接触到磷酸盐缓冲液时的流变学考察和细胞培养基中水凝胶形态和药物作用的观察，初步表明了自组装短肽原位水凝胶体内应用的可能性。但需要进一步开展深入的细胞和动物试验以充分验证其可行性。

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[收稿2016-01-25;修回2016-03-30]

(编辑：王静)

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO：31460246)；贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合LH字[2014]7564)；遵义医学院博士科研启动基金资助项目(NO：F-583)。

[中图法分类号]R943；O641.2

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)03-0250-05

Rheology study on construction of in-situ hydrogel containing 5-fluorouracil with self-assembling peptide

TangFushan1,MengCui1,YangChunxian1,YuanLingyan2

(1. School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.School of Nursing, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate potential of self-assembling peptide RAD16-I as in-situ hydrogel for 5-fluorouracil.Methods Hydrogel formation of 5-fluorouracil-contained RAD16-I solution and the effect of 5-fluorouracil in the hydrogel were studied through rheology study on hydrogel and microscopic observation on hydrogels and cells cultured in the hydrogels.Results Hydrogel with certain mechanical intensity formed rapidly in 5-fluorouracil contained RAD16-I solutions immediately after they were mixed with PBS. Also, in cell culture media, RAD16-I solutions containing 5-fluorouracil can form hydrogels, which can keep their gel form and effects on cancer cells in the cell culture media.Conclusion The self-assembling peptide may be explored as in-situ hydrogel carrier for anti-cancer drugs.

[Key words]self-assembling peptide; 5-fluorouracil; in-situ hydrogel; rheology; drug carrier materials