金钗石斛总生物碱对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响

姜琳珊，李　菲，聂　晶，吴　芹，石京山

(遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室暨药理学教研室，贵州 遵义　563099)



基础医学研究

金钗石斛总生物碱对APP/PS1转基因小鼠学习记忆能力的影响

姜琳珊，李菲，聂晶，吴芹，石京山

(遵义医学院 基础药理省部共建教育部重点实验室暨药理学教研室，贵州 遵义563099)

[摘要]目的 初探贵州省产金钗石斛总碱(DNLA)对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆的影响。方法 雄性APP/PS1转基因小鼠随机分为模型对照组、模型给药组(DNLA，40 mg/kg)，同月龄野生型小鼠作为空白对照组，每组10只。自7月龄始灌胃给药，连续8周。Morris水迷宫及Y迷宫检测小鼠空间学习记忆能力，尼氏染色观察小鼠海马神经元形态。结果 Morris水迷宫定位航行实验显示，模型组逃避潜伏期较空白对照组明显延长(P<0.05)；空间探索实验显示，模型组小鼠在原平台象限停留时间及在原平台象限游泳距离的百分比较空白组明显缩短(P<0.05)；模型组小鼠在Y迷宫的空间自发性探索行为正确率明显低于空白组。尼氏染色结果显示，模型组小鼠海马神经元排列疏松，神经元数量及尼氏小体减少，胞质呈淡蓝色。与模型组比较，DNLA 40 mg/kg明显缩短小鼠逃避潜伏期(P<0.05)；增加小鼠在原平台象限停留时间及原平台象限游泳距离的百分率 (P<0.05)、明显增加Y迷宫小鼠自发探索行为正确率(P<0.05)，并改善模型小鼠海马CA1区神经元的形态和结构。结论 DNLA对APP/PS1转基因小鼠空间学习记忆能力具有改善作用。

[关键词]阿尔茨海默病；金钗石斛总生物碱；学习记忆；APP/PS1转基因小鼠；平台象限；海马神经元

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD )又称为老年性痴呆，是一种好发于中老年的中枢神经系统退行性疾病，以进行性记忆与认知功能障碍为特点，严重危害了中老年人的身心健康，目前仍没有良好的药物治疗。利用我国丰富的中药资源，寻找对AD有效的防治药物迫在眉睫。金钗石斛是贵州省道地中药材，资源丰富，我室前期研究表明金钗石斛总碱(DendrobiumnobileLindl. Alkaloids, DNLA)对大鼠神经具有良好的保护作用[1-2]，而DNLA是否对AD转基因动物具有改善作用，未见报道。故本研究采用APP/PS1双转基因小鼠为实验对象，通过行为学检测初探DNLA对AD的改善作用，为DNLA用于防治AD进行有益的探索。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物雄性APP/PS1转基因小鼠、同月龄野生型小鼠，SPF级，体重为(20±5) g，均由南京模式动物研究所提供[合格证号：SCXK苏2010-0001]。饲养于遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室SPF级动物房。

1.1.2药品与试剂DNLA总碱由遵义医学院基础药理省部共建教育部重点实验室提取，采用UPLC-MS分析，DNLA纯度79.8%，提取和测定方法参照文献[3]。甲苯胺蓝购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3主要仪器Morris水迷宫、Y迷宫和TopScan 3.0行为学分析系统(北京吉安得尔科技有限公司)， JY502电子天平(北京赛多利斯电子有限公司)，BX43正置显微镜 (日本奥林巴斯公司)。

1.2方法

1.2.1实验分组APP/PS1转基因小鼠随机分为模型组和DNLA组，同月龄野生型小鼠作为空白对照组，每组10只。DNLA组每日灌胃DNLA 40 mg/kg，模型组与空白对照组给予等体积生理盐水，各组小鼠从7月龄时开始给药，连续8周。

1.2.2Morris水迷宫实验给药结束前8 d，采用Morris水迷宫进行空间学习记忆检测，分为定位航行实验和空间探索实验两部分。定位航行指小鼠每次从平台所在象限外的任一象限，面向水池壁入水，测试小鼠找到水中平台所需时间，计为逃避潜伏期(s)，若60 s内未能找到，则逃避潜伏期为60 s，并将其引导至平台上停留20 s。定位航行每天3次连续6 d。第7天行空间探索实验(测试小鼠对原平台的记忆)，即撤去平台，将小鼠从原平台所在象限的对面象限放入水中，观察并记录60 s内小鼠在原平台象限停留时间及目的象限内游泳距离与游泳总距离的百分比。

1.2.3Y迷宫实验给药结束前1天，采用Y迷宫进行自发选择性行为学实验(见图1)，用以判断小鼠学习记忆能力。小鼠被置于一个臂端面朝中心，允许每只小鼠自由探索10 min。每次进入臂内的标准为：小鼠身体100%进入臂内记为一次进入。一次成功的探索定义为：在一系列探索中，动物依次进入3个不同的臂内(如：3-1-2，2-3-1，1-3-2)。正确率(%)=正确选择次数/(总穿臂次数-2)×100%。

图1　自发性选择性行为实验示意图

1.2.4尼氏染色Y迷宫结束后第2天麻醉所有动物，每组随机取3只小鼠行PBS及4%多聚甲醛透心灌注，收集脑组织，石蜡切片，进行尼氏染色。在光学显微镜(40×物镜)下观察CA1区海马神经元数量、形态及尼氏小体。每只小鼠选取相同冠状切面的切片5张。具体实验操作步骤参照文献[4]。

2结果

2.1DNLA对小鼠空间学习记忆能力的影响Morris水迷宫定位航行实验结果显示，各组小鼠第1、2天逃避潜伏期无明显差异，自第3天始模型组小鼠逃避潜伏期较空白组明显延长(P<0.05)，空白对照组逃避潜伏期自第3天始分别为30.31、33.23、33.78、28.66 s；模型组逃避潜伏期分别为53.51, 53.17, 53.15, 52.77 s，DNLA组小鼠逃避潜伏期自第3天始分别为42.13、41.93、42.39、38.97 s，较模型组明显缩短(P<0.05，见图2)。在空间探索实验中，模型组小鼠在原平台象限停留时间和目的象限内占游泳总距离的比率明显降低(P<0.05)，给予DNLA后原平台象限内停留时间和目的象限占游泳总距离的比率较模型组明显增加(P<0.05，见图3)。Y迷宫结果显示，模型组小鼠的空间自发性探索行为正确率明显低于空白组，而给予DNLA后，小鼠的自发性探索行为正确率较模型组明显增加(P<0.05，见图4)。

；*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05。图2　金钗石斛总碱对小鼠逃避潜伏期的影响

；*：与空白对照组相比，P<0.05；#：与模型组相比，P<0.05。图3　金钗石斛总碱对小鼠原平台象限游泳距离百分比和停留时间的影响

；*：与空白对照组相比，P<0.05；#:与模型组相比，P<0.05。　　图4　金钗石斛总碱对Y迷宫小鼠空间自发性探索行为的影响

2.2DNLA对小鼠海马神经元形态的影响尼氏染色光镜下观察发现，空白对照组小鼠海马CA1区锥体细胞结构清晰，排列整齐，尼氏小体丰富，明显的虎斑状染色；而模型组小鼠海马神经元排列松散，数量减少，尼氏小体染色浅；与模型组比较，DNLA治疗后，海马CA1区神经元排列较整齐，神经元及尼氏小体数量增多(见图5)。

3讨论

据AD流行病学研究报道，2020年全球有0.423亿人患有痴呆，到2040年这一数字将达到0.811亿，而这其中有60%～70%的人患阿尔茨海默病[5]。因此，阿尔茨海默病已成为重大的公共卫生问题和研究的热点。基因突变是AD的一个重要发病机制，主要与1号染色体上早老素2(Presenilin-2,PS-2)基因、14号染色体上PS-1基因、19号染色体载脂蛋白E(ApoE)基因和21号染色体β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,β-APP)基因的突变有关[6]。在对AD的研究中，采用可靠的动物模型至关重要。APP/PS1双转基因小鼠模型的特点是将APPswe、PSEN1de9这2个基因整合在一起，能够很好地模拟AD主要病理学的改变，如神经元缺失、炎症损伤和Aβ沉积等[7]。因此，本实验采用该转基因模型小鼠判断金钗石斛总碱抗AD的作用。

A: 空白对照组; B: 模型组; C: DNLA组。图5　金钗石斛总碱对小鼠海马神经元细胞的影响(尼氏染色，×400)

AD患者主要的临床表现为学习记忆的进行性减退，有报道称APP/PS1转基因小鼠在9月龄时即出现学习记忆受损，在水迷宫实验中呈现明显的学习记忆障碍[8]。Morris水迷宫实验是让实验大鼠学习在水中寻找隐藏平台，记录其找到平台所需时间和行走路径，测试动物对空间定位的学习记忆能力，判断其记忆功能。Y迷宫实验是一种对小鼠自发选择性行为的空间记忆能力的检验[9]，不需要经过特定训练。本实验自小鼠7月龄始给予DNLA连续8周，实验结果显示，与空白组比较，转基因(模型)小鼠在Morris水迷宫定位航行的逃避潜伏期明显延长；在空间探索实验中，模型小鼠原平台象限停留时间、目的象限游泳距离所占比率明显减少；在Y迷宫的空间自发性探索行为检验中，小鼠空间探索的正确率明显降低。同时病理学检测发现，APP/PS1转基因小鼠海马CA1区，神经元数量及尼氏小体均减少。小鼠连续8周灌胃DNLA后与模型组比较，其游泳逃避潜伏期明显缩短、平台象限停留时间和平台象限游泳距离所占比率均明显增加；Y迷宫用药小鼠空间探索的正确率明显提高，病理学可见在小鼠海马CA1区，DNLA组较之模型组神经元数量及尼氏小体增多，进一步佐证DNLA在一定程度上具有保护神经元的作用，有关DNLA的作用机制值得进一步研究。

[参考文献]

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[2] 张明辉. 金钗石斛总生物碱对Aβ25-35所致大鼠海马组织Aβ含量的影响[J]. 遵义医学院学报, 2016, 39(1): 18-21.

[3] 赵福坤, 吴芹, 陆远富, 等. 金钗石斛总生物碱提取及含量测定方法的改进[J]. 遵义医学院学报, 2015, 38(5): 532-535.

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[5] Ballard C, Gauthier S, Corbett A, et al. Alzheimer's disease[J]. Lancet, 2011, 377(9770): 1019-1031.

[6] 程青格, 徐平, 龚其海. 阿尔茨海默病的发病机制及治疗研究进展[J]. 遵义医学院学报, 2013, 36(6): 586-589.

[7] 高雅, 王鲁宁, 张红红. APP swe/PS1dE9双转基因阿尔茨海默病模型小鼠生物学特征[J]. 中华老年心脑血管病杂志, 2015, 17(1): 106-108.

[8] Zhang Q, Du X, Xu Y, et al. The effects of gouqi extracts on morris maze learning in the App/ps1 double transgenic mouse model of alzheimer's disease[J]. Experimental & Therapeutic Medicine, 2013, 5(5): 1528-1530.

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[收稿2016-03-22;修回2016-04-15]

(编辑：王静)

[基金项目]国家自然科学基金资助项目(NO:81473201)；贵州省教育厅自然科学基金资助项目(NO:黔教科2010043)。

[通信作者]石京山，男，博士，博士生导师，研究方向：神经药理学，E-mail:shijs@zmc.edu.cn。

[中图法分类号]R285.5

[文献标志码]A

[文章编号]1000-2715(2016)03-0246-04

Effect ofDendrobiumnobileLindl. alkaloids on the learning and memory function of APP/PS1 transgenic mice

JiangLinshan,LiFei,NieJing,WuQin,ShiJingshan

(Department of Pharmacology, The Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To explore the effects of Dendrobium nobile Lindl. alkaloids (DNLA) on the spatial learning and memory function of APP/PS1 transgenic mice.Methods Male APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into model and DNLA (40 mg/kg) groups, age-matched wildtype mice as controls ten mice in each group. Administration was performed from 7 months of age, and continued for 8 weeks. Morris water maze and Y maze were used to test the spatial learning and memory abilities. Nissl’s staining was used to observe the morphological changes of hippocampus neurons.Results Place navigation tests of Morris water maze showed that the escape latency was longer in model group than control group (P<0.05), while the probe trial assay data demonstrated that the time and the percentage of distance in the target quadrant were decreased in model group (P<0.05). The percentage of spontaneous alternation behavior correction in model group was decreased. The numbers of neurons and Nissl’s bodies were decreased in model group by Nissl’s staining,Compared with model group, DNLA 40 mg/kg reduced the escape latency (P<0.05), increased the time and the percentage of distance in the target quadrant (P<0.05), increased the percentage of spontaneous alternation behavior correct rates (P<0.05), and improved the morphology and structure in CA1 area of hippocampus.Conclusion DNLA has the ability of improving the spatial learning and memory function of APP/PS1 mice.

[Key words]Alzheimer’s disease; Dendrobium nobile Lindl. Alkaloids; learning and memory; APP/PS1 transgenic mice; platform quadrant; hippocampal neuron